Construction de modèles de puce microfluidique pour la construction et l’analyse multi-omique

Nous avons développé des puces microfluidiques à grande échelle pour permettre l’analyse multiomique, dans le but d’illustrer le mécanisme métabolique des neurones suite à une lésion axonale. Nous utilisons principalement la technologie microfluidique, l’analyse des flux métaboliques et la transcriptomique pour faire avancer la recherche sur les mécanismes métaboliques des neurones lors des lésions axonales et de la régénération. Nous avons constaté qu’il existe des différences métaboliques entre les neurones corticaux à différentes maladies du développement, et que les jeunes neurones subissent un remodelage métabolique après une lésion externe.

Le principal avantage de notre protocole réside dans la conception de la plate-forme microfluidique à plus grande échelle et les normes opérationnelles, qui permettent une multiomique précise et la taille de millions de cellules. Pour commencer, transférez la base PDMS et l’agent de durcissement dans un tube à centrifuger. Placez le tube à centrifuger contenant le mélange dans un mélangeur centrifuge.

Centrifuger à 2 000 G pendant quatre minutes deux fois pour mélanger et dégazer. Versez 13 à 15 grammes du PDMS dégazé dans le moule microfluidique, en veillant à ce que le fond du moule soit complètement couvert. Maintenant, placez le moule dans un dessiccateur sous vide, puis utilisez une pompe à vide pour évacuer l’air pendant cinq à 10 minutes afin d’éliminer complètement les bulles du PDMS.

À l’aide d’une poire en caoutchouc, tapotez doucement la surface du PDMS pour briser les bulles de surface restantes. Transférez le moule dans un four à convection et faites cuire à 80 degrés Celsius pendant 100 minutes pour durcir le polydiméthylsiloxane. Une fois que le PDMS est complètement durci, glissez doucement la pointe d’un scalpel sous le bord du PDMS pour le soulever et le séparer délicatement du moule.

À l’aide d’un poinçon de biopsie d’un diamètre de 2,0 à 2,5 millimètres, créez des trous dans le PDMS pour la perfusion du milieu de culture et le chargement cellulaire. Enlevez toutes les impuretés de surface du PDMS à l’aide de ruban adhésif, puis placez-le dans un plat en verre propre et enveloppez-le de papier d’aluminium pour le stockage. Avant l’expérience, autoclavez le dispositif microfluidique à 121 degrés Celsius et 101 kilopascals pendant cinq minutes pour garantir la stérilité.

Placez une lamelle destinée aux dispositifs microfluidiques conventionnels dans une boîte de culture de 35 millimètres. Ajoutez deux millilitres de solution de poly-D-lysine de 0,1 milligramme par millilitre dans le plat. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant six heures ou toute la nuit.

Après l’incubation, récupérez soigneusement la solution de poly-D-lysine pour la réutiliser ou l’éliminer correctement. Maintenant, ajoutez deux millilitres d’eau stérile ultrapure dans le plat. Tournez-le 50 fois dans le sens des aiguilles d’une montre, puis 50 fois dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.

Aspirer l’eau à l’aide d’une pompe à vide reliée à une pointe de pipette stérile, en recueillant les déchets dans un conteneur de déchets liquides. Une fois tous les lavages terminés, laissez les lamelles sécher naturellement à l’air libre dans une enceinte de biosécurité avant de les utiliser. À l’aide d’une pince stérile à pointe fine, placez la puce microfluidique autoclavée au centre de la surface du verre, les microcanaux vers le bas.

Appuyez doucement la puce sur la surface du verre à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour assurer une adhérence complète. Ensuite, marquez la chambre gauche avec un point à l’aide d’un marqueur permanent pour désigner le compartiment soma. Aspirez 10 microlitres de suspension neuronale à l’aide d’une pipette de 10 microlitres, puis distribuez lentement la suspension dans l’orifice de chargement au-dessus du compartiment soma marqué.

Confirmez que le fluide s’écoule correctement dans le réservoir inférieur de la chambre gauche. Transférez la boîte de culture dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 20 minutes. Après l’incubation, placez la boîte sous un microscope 20X pour confirmer la profusion de milieux du compartiment soma au compartiment axonal à travers les microcanaux.

Maintenant, pipetez 150 microlitres de milieu basal neuronal jusqu’à l’orifice supérieur du compartiment axonal. De même, ajoutez 150 microlitres de milieu neuronal complet à l’orifice supérieur du compartiment soma. Ensuite, versez 20 millilitres d’eau ultrapure dans une boîte de culture de 150 millimètres pour créer une chambre d’humidité.

Placez la boîte de culture de 35 millimètres à l’intérieur de la grande boîte, puis transférez l’ensemble du système de culture dans l’incubateur et maintenez-le pendant la durée requise. Utilisez une boîte de Pétri de 10 centimètres de large pour placer le dispositif microfluidique à grande échelle. Choisissez l’ensemencement de canaux complets ou d’intervalles en fonction des besoins expérimentaux, car chaque méthode nécessite des protocoles de lésions axonales différents.

Une fois l’ensemencement terminé, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture de neurones complet dans la boîte de Pétri pour maintenir la croissance des neurones. Transférez une quantité appropriée de milieu basal neuronal dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres pour une utilisation ultérieure. Placez un dispositif microfluidique contenant des neurones corticaux sur un banc propre.

À l’aide de papier non pelucheux, séchez le fond de la boîte de culture de 35 millimètres, puis utilisez une pipette de 200 microlitres pour aspirer le milieu par les deux trous latéraux droits du dispositif microfluidique. Ensuite, connectez un tube de pompe à vide à une pointe de pipette stérile et sans filtre de 200 microlitres. Allumez la pompe à vide à un taux d’aspiration de 60 litres par minute et dirigez l’extrémité vers le point de connexion entre le trou inférieur de la chambre terminale de l’axone et la chambre pour aspirer l’ancien fluide, provoquant la rupture de l’axone en raison d’une pression négative.

Replacez l’embout de la pipette et prélevez 150 microlitres de milieu basal neuronal, en l’ajoutant lentement par le trou inférieur de la chambre droite. Après avoir effectué l’addition et l’aspiration quatre fois, remplacez par un milieu neuronal complet frais, puis aspirez l’ancien milieu du trou latéral du corps cellulaire et ajoutez un milieu neuronal complet frais contenant des médicaments si nécessaire. Placez le dispositif microfluidique avec la boîte de culture dans une boîte de culture de 150 millimètres et poursuivez la culture pendant la durée requise, par exemple 24 heures.

Pour les lésions axonales manuelles, ensemencez les neurones dans toutes les chambres du dispositif microfluidique à grande échelle. Incuber l’appareil à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours. Le septième jour in vitro, retirez la boîte de culture contenant le dispositif microfluidique de l’incubateur et placez-la sur une scène stérile.

Préparez un microscope avec un grossissement de 20X et stérilisez la zone de travail avec de l’éthanol à 75 %. Tenez une pointe de pipette filtrée stérile de 10 microlitres et identifiez les faisceaux axonaux dans les microcanaux d’origine sous guidage au microscope. Effectuez des rayures longitudinales le long de chaque faisceau d’axones à l’aide de la pointe de la pipette.

Observez la rupture des axones au microscope en temps réel. Les microcanaux d’un dispositif microfluidique standard permettent la croissance des axones, mais pas du soma, comme le confirme la coloration de la tubuline bêta-trois après sept jours in vitro. La densité neuronale n’a montré aucune différence significative après une lésion axonale, indiquant qu’il n’y a pas de mort neuronale observable.

Un dispositif microfluidique à grande échelle avec une conception extensible tridimensionnelle a été développé pour les analyses multiomiques. Les répliques PDMS non perforées et perforées adhèrent solidement à des paraboles de 10 centimètres ou à des cartes de circuit imprimé. Les lésions axonales induites par le grattage de la pointe de la pipette ont conduit à des axones clairement sectionnés avec une morphologie perturbée, contrairement aux axones intacts avant la lésion.

Une régénération axonale a été observée à la fois six heures et 24 heures après la blessure, tandis que les axones non blessés sont restés stables. La concentration en protéines neuronales a augmenté de manière significative, passant de 1420,4 microgrammes par millilitre au départ à 1748,9 par millilitre six heures après la blessure et à 1823,7 microgrammes par millilitre 24 heures après la blessure. Les rendements en ARN des groupes témoins et des groupes endommagés par les axones étaient presque identiques.

Le séquençage de l’ARN a révélé 595 gènes spécifiques aux lésions et 609 gènes spécifiques au contrôle, avec 17 471 gènes partagés entre les groupes. L’analyse de la voie KEGG a révélé une régulation positive significative de la phosphorylation oxydative, de la réponse des espèces réactives de l’oxygène, de l’autophagie et des voies cycliques du TCA après la blessure.