Évaluation des interventions thérapeutiques dans le modèle murin déficient en SHIP de l’iléite et de la fibrose semblables à la maladie de Crohn

Nous utilisons des souris déficientes en SHIP pour étudier les mécanismes qui favorisent l’inflammation intestinale et la fibrose dans la maladie de Crohn et pour évaluer de nouveaux médicaments ou stratégies thérapeutiques pour traiter la maladie de Crohn. Nous avons donc utilisé ce modèle dans des études précliniques pour démontrer l’efficacité des médicaments contre la MII au glycogène pour une administration ciblée de médicaments. Notre protocole utilise des souris déficientes en SHIP, qui développent naturellement une inflammation iléale et une fibrose, offrant un modèle physiologiquement plus pertinent que les modèles traditionnels induits chimiquement ou basés sur des blessures.

Nos résultats établissent que les souris déficientes en SHIP constituent un modèle robuste d’inflammation et de fibrose iléales, permettant des études mécanistes et des essais précliniques de thérapies pour la maladie de Crohn. Pour commencer, jeûnez les souris pendant quatre heures avant de réaliser le test. Dissoudre quatre kilodalton de FITC-dextran dans un PBS stérile pour atteindre une concentration finale de 80 milligrammes par millilitre.

Ensuite, attachez doucement chaque souris et administrez 150 microlitres de la solution FITC-dextran par voie orale, puis laissez les souris sans nourriture pendant encore quatre heures après le gavage. Après avoir euthanasié la souris, effectuez une ponction cardiaque à l’aide d’une aiguille calibre 25 et d’une seringue d’un millilitre pour prélever le sang. Ajoutez immédiatement 10 microlitres de solution acide-citrate-dextrose à chaque 100 microlitres de sang collecté comme anticoagulant.

Mélangez soigneusement en inversant le tube plusieurs fois. Centrifugez les échantillons de sang collectés à 1 500 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez soigneusement le plasma dans des tubes microcentrifugeuses de 1,7 millilitre marqués.

Gardez tous les échantillons sur la glace et à l’abri de la lumière jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse. Maintenant, diluez chaque échantillon de plasma à des rapports de un à deux et un à dix à l’aide du PBS. Ajoutez 100 microlitres de chaque dilution plasma dans une plaque opaque de 96 puits, en les plaçant dans des puits en double.

Effectuer une à deux dilutions sérielles du stock FITC-dextran original de 80 milligrammes par millilitre en utilisant le PBS pour préparer différentes concentrations de la solution. Ajoutez 100 microlitres de chaque dilution dans des puits en double de la plaque de 96 puits. Ensuite, mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de microplaques réglé à 485 nanomètres pour l’excitation et 535 nanomètres pour l’émission.

Après la prise de sang Pour le test FITC-dextran, exciser soigneusement l’intestin grêle entier de la souris. Retirez doucement toute graisse et tissu conjonctif attachés de l’intestin. Posez l’intestin nettoyé à plat sur une feuille blanche vierge pour accentuer le contraste visuel.

Examinez visuellement le tissu pour détecter tout signe macroscopique de maladie, en portant une attention particulière aux 10 centimètres distaux chez les souris SHIP knockout, où l’inflammation est fréquemment présente. Alignez l’intestin à côté d’une règle pour fournir des écailles et photographiez l’ensemble du sémimen pour documenter toute découverte pathologique grave. Rinçez doucement la lumière intestinale avec du PBS à l’aide d’une seringue pour retirer tout contenu intestinal tout en évitant une force excessive afin d’éviter la déformation des villosités et de l’architecture cryptique.

Identifier la région de l’iléon distal la plus représentative de la pathologie globale et exciser environ un centimètre de tissu. Posez le tissu excisé à plat dans une cassette histologique et placez-le entre deux éponges pour éviter le plissement lors de la fixation. Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine et la coloration trichrome de Masson, fixez le tissu dans du formol tamponné à 10 % neutre en utilisant 10 à 20 fois le volume tissulaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Après fixation, transférez les cassettes à 70 % d’éthanol pour le stockage et assurez-vous qu’elles restent complètement immergées jusqu’au traitement. Pour le bleu d’Alcien et la coloration périodique acide-Schiff, fixez le tissu dans la solution de Carnoy toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après fixation, transférez les cassettes à 100 % d’éthanol pour les stocker jusqu’au traitement.

Ensuite, plongez les tissus fixés dans la paraffine et séparez-les en tranches de cinq micromètres pour une coloration ultérieure. Évaluer les sections iléales colorées à l’hématoxyline et à l’éosine à l’aide d’une échelle de 16 points selon des critères histopathologiques définis. Évaluer les sections transversales colorées trichrome de Masson à l’aide d’une échelle de six points basée sur des critères prédéfinis.

Calculer le score final de fibrose comme la médiane des scores attribués par deux évaluateurs indépendants aveuglés aux conditions expérimentales. Après la dissection et le prélèvement de l’échantillon d’histologie, prélever la portion restante des 10 centimètres distaux de l’iléon. Séchez les mouchoirs collectés avec un essuie-tout ou une lingette sans peluches, puis notez le poids du tissu à l’aide d’une balance calibrée.

Congelez rapidement le tissu dans de l’azote liquide avant de le stocker à moins 80 degrés Celsius pour un traitement ultérieur. Lorsque vous êtes prêt à être traité, récupérez le tissu congelé et maintenez-le toujours sur la glace. Ensuite, peser à nouveau les échantillons de tissu pour confirmer la masse exacte.

Préparez le tampon d’homogénéisation en ajoutant un inhibiteur de protéase au PBS. Utilisez 10 microlitres de tampon par milligramme de tissu. À l’aide d’un homogénéiseur de laboratoire de travail, homogénéisez le tissu ileal d’épaisseur complète dans un tampon d’homogénéisation glacé.

Continuez jusqu’à ce que l’homogénéat soit uniforme et exempt de fragments de tissu visibles. Rincez soigneusement la pointe homogénéisante avec du PBS entre les échantillons pour éviter toute contamination croisée. Centrifugez le tissu homogénéaïsé à 10 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Aliquote les surnatants clarifiés en volumes plus petits pour éviter les cycles de gel-dégel, puis stocke-les à moins 80 degrés Celsius pour une analyse ultérieure. L’analyse histologique a révélé des lésions intestinales significativement plus importantes chez les souris déficientes en SHIP par rapport aux témoins en SHIP. Le traitement à la dexaméthasone a réduit les dommages histologiques chez les souris déficientes en SHIP, bien que cette diminution n’ait pas été statistiquement significative.

La coloration trichrome de Masson a montré une augmentation significative du dépôt de collagène chez les souris déficientes en SHIP par rapport aux témoins en SHIP, indiquant des scores de fibrose plus élevés. Le traitement à la dexaméthasone a nettement réduit la fibrose chez les souris déficientes en SHIP, rapprochant les scores des témoins positifs en SHIP. La coloration en bleu d’alcien et en PAS a confirmé l’hyperplasie des cellules caliciformes chez des souris déficientes en SHIP, qui a été visiblement réduite après le traitement à la dexaméthasone.

Les concentrations d’IL-1 bêta étaient significativement élevées chez les souris déficientes en SHIP par rapport aux témoins SHIP. La dexaméthasone a significativement réduit les concentrations d’IL-1bêta chez les souris déficientes en SHIP. Les concentrations de MPO étaient significativement élevées chez les souris déficientes en SHIP par rapport aux témoins SHIP, et cette augmentation a été réduite par la dexaméthasone sans atteindre une signification statistique.

Les concentrations de LCN-2 étaient également élevées chez les souris déficientes en SHIP, mais les valeurs élevées n’ont pas été systématiquement réduites par la dexaméthasone. Les concentrations d’IL-1 bêta étaient positivement corrélées avec les scores de lésions histologiques et de fibrose, indiquant un lien entre inflammation et lésion tissulaire. Les scores de lésions histologiques étaient positivement corrélés aux scores de fibrose, suggérant que les lésions tissulaires et le remodelage fibrosique progressaient en parallèle.