Flux de travail standardisé SDS-PAGE pour le profilage personnalisé de la corona protéique dans la détection précoce du cancer

Nous étudions comment les nanoparticules interagissent avec le sang pour révéler les premiers signes du cancer, dans le but d’un test diagnostique simple, reproductible et principalement non invasif. Pour commencer, diluez la solution de quatre milligrammes par millilitre de nanofeuilles d’oxyde de graphène dans de l’eau ultrapure jusqu’à la concentration souhaitée. Sonicez la solution diluée pendant deux minutes à 28 % d’amplitude avec une impulsion de huit secondes allumée et six secondes éteinte pour assurer une dispersion uniforme.

Quantifiez la concentration de la solution dispersée à l’aide de la spectroscopie ultraviolet-visible. Ensuite, on mesure la taille hydrodynamique et le potentiel zêta de la solution à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière avec un laser néon hélique de 633 nanomètres. Diluez l’échantillon dans de l’eau ultrapure selon les limites de détection QVet.

Ensuite, diluez le plasma humain lyophilisé commercial avec de l’eau ultrapure selon les besoins. Centrifugez le plasma reconstitué à 18 620 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation supplémentaire.

Quantifions maintenant la concentration en protéines à l’aide du test d’acide bicinchoninique pour ajuster la dilution du plasma et déterminer le rapport optimal nanoparticules/plasma. Mélangez le volume sélectionné de nanoparticules avec du plasma pour obtenir le ratio cible entre les deux. Faites couver le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Pour isoler la couronne protéique, centrifugez les échantillons de plasma de nanoparticules à 18 620 G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Lavez la granule obtenue avec 200 microlitres d’eau ultrapure. Puis resuspendez-le et centrifugez à nouveau.

Après le lavage final, confirmez la présence d’un granule compact comme preuve d’isolation d’un complexe protéique de nanoparticules. Ensuite, mélangez l’agent réducteur, le tampon de charge et l’eau pour atteindre le volume tampon calculé. Résuspendez la pastille dans le tampon de chargement préparé.

Ensuite, faites bouillir la suspension à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifugez l’échantillon bouilli à 18 620 G à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Collectez le surnageant dans un nouveau tube.

Préparez maintenant l’échelle des protéines en diluant l’étalon de poids moléculaire dans un tampon non coloré avec le tampon coloré. Diluer 10 x Tris-Glycine-SDS en tampon de fonctionnement à une x concentration. Montez la chambre d’électrophorèse avec un gel à gradient sans coloration de 4 à 20 %.

Ensuite, versez le tampon de fonctionnement jusqu’à atteindre le niveau recommandé indiqué par le fabricant. Chargez 10 microlitres d’échantillon dans chaque puits. Ensuite, pipettez sept microlitres d’échelle dans chaque puits.

Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant environ 90 minutes à température ambiante. Stockez l’image gel sous forme de fichier tiff dans le même dossier que les scripts. Ensuite, le traitement gel ouvert.

M à MATLAB. Entrez le nom de l’image gel comme nom d’image. Ensuite, entrez l’index d’une voie d’échelle comme marqueur d’index.

Exécute le script. La fin des étapes sera indiquée dans la fenêtre de commande et quatre fenêtres apparaîtront à l’écran. Maintenant, ouvrez la figure un avec l’image gel originale en haut et sa correction pour l’effet de voie oblique en bas.

Modifiez les valeurs de la correction à gauche et de la correction à droite pour ajuster les paramètres de correction. Ouvre la Figure Deux. Il contient l’image corrigée pour l’effet de voie oblique en haut et l’image de fond supprimée en bas.

Ajustez la valeur de BKG par X dans le script pour régler la suppression de fond. Observez que toutes les voies identifiées sont indiquées par des lignes blanches verticales dans la Figure Deux. Maintenant, ouvrez la Figure Trois contenant le profil d’intensité de la voie de marqueur avec les pics détectés à gauche et un ajustement non linéaire avec la valeur de R carré à droite.

Vérifiez que le nombre de bandes attendues dans la voie de l’échelle correspond au nombre de pics détectés utilisés pour la procédure d’ajustement. Ouvrez ensuite la Figure Quatre contenant les profils d’intensité normalisés pour toutes les voies détectées dans le gel. Définissez le paramètre d’exportation à un pour exporter les profils d’intensité en fonction des poids moléculaires dans un fichier Excel.

Exécute le script. Après l’achèvement, une feuille Excel sera générée dans le dossier de travail contenant les profils absolu et normalisé en fonction du poids moléculaire dans la première colonne. Ensuite, ouvre le fichier gel profiles pro m et lance le script.

Quatre fenêtres apparaîtront sur l’écran. Ouvrez la Figure Cinq contenant les profils d’intensité absolue en haut et les intensités totales correspondantes en bas pour chaque voie. Et la Figure Six contenant les profils d’intensité normalisés pour chaque voie.

L’axe du poids moléculaire est subdivisé selon les plages spécifiées en régulation dans le script. Réglez les données d’exportation à un pour exporter les intégrales absolues et normalisées. Exécute le script.

Après l’achèvement, un tableau est généré dans le dossier de travail contenant les zones absolues et normalisées exportées dans les plages de poids moléculaire spécifiées. Enfin, ouvrez les figures Sept et Huit. Ils contiennent l’histogramme des aires absolue et normalisée pour chaque voie, regroupées respectivement par voie et par aire.

Le protocole présenté ici établit un flux de travail standardisé et reproductible pour isoler et caractériser la couronne protéique formée sur les nanoparticules après incubation avec plasma. Cette méthode permet de produire des profils de pages SDS très cohérents, capables de capturer des caractéristiques biologiquement significatives et diagnostiquement pertinentes de chaque couronne personnalisée. Les profils de pages SDS obtenus dans toutes les conditions étaient hautement reproductibles.

L’augmentation des concentrations plasmatiques de 5 % à 50 % a entraîné des intensités de signal plus fortes dans la région de 30 à 80 kilodaltons des profils de pages SDS. Le flux de travail automatisé de pipetage a donné des profils électrophorétiques presque identiques. L’oxyde de graphène produisait constamment des profils coronales stables bien résolus, attribués à sa grande surface et à ses propriétés chargées.

La répartition des tailles des échantillons d’oxyde de graphène petit, moyen et grand était étroite, non chevauchant et centrée respectivement autour de 100, 300 et 750 nanomètres. Les profils de pages SDS des Coronas protéiques formées sur l’oxyde de graphène étaient similaires sur toutes les tailles. Bien que des différences distinctes aient été observées entre différentes dilutions, des concentrations plasmatiques plus faibles produisaient des bandes plus intenses dans certaines plages de poids moléculaire, indiquant un enrichissement sélectif des protéines.

Aux dilutions plasmatiques intermédiaires, les profils métriques de densité ont révélé des différences spécifiques à la maladie, notamment dans la région des 20 à 30 kilodaltons où les échantillons de PDAC ont montré une intensité de signal réduite. Le modèle de profilage SDS basé sur les pages identifiait correctement à lui seul à la fois les échantillons PDAC et témoins avec une précision de 83 % et une sensibilité et spécificité équilibrées. Le modèle diagnostique combiné, intégrant les profils corona des pages SDS et les niveaux CA 19 à 9, atteint la plus grande précision, sensibilité et spécificité dans la classification des patients PDAC.

Nous utilisons des flux de travail automatisés, des techniques non technologiques et des outils pilotés par l’IA pour faire progresser la recherche diagnostique du cancer. Notre protocole est rapide, convivial, conforme à l’OMS, garantissant les empreintes digitales reproductibles standardisées de la corona protéique avec une forte pertinence diagnostique.