Amyloïde et l’architecture cross-bêta

Nos recherches utilisent la diffraction des fibres de rayons X pour étudier la structure de la fibrille amyloïde croisée bêta et son organisation moléculaire. Ce protocole utilise la diffraction des fibres aux rayons X pour confirmer les motifs croisés bêta et élucider les architectures de fibrilles. Ce protocole permet l’analyse structurelle des fibrilles amyloïdes, de la confirmation de l’organisation bêta croisée à l’élucidation de détails moléculaires supplémentaires.

Pour commencer, alignez les fibrilles protéiques ou peptidiques pour former un faisceau dont les axes fibreux sont idéalement tous parallèles. Faites fondre la cire de bougie avec une plaque chauffante jusqu’à ce qu’elle se liquéfie. À l’aide d’un coupe-verre, coupez des capillaires en verre borosilicaté d’un millimètre sur une longueur d’environ 2 à 3 centimètres.

Trempez brièvement les capillaires coupés dans la cire liquide. Ensuite, faites monter la cire de bougie par capillaire à environ 1 à 2 millimètres à l’intérieur du capillaire. Utilisez maintenant de la pâte à modeline pour fixer horizontalement les capillaires scellés à l’intérieur d’une boîte de Petri.

Maintenez un espace de 0,5 à 2 millimètres entre les extrémités remplies de cire des capillaires. Avec une pipette, suspendez soigneusement une gouttelette de 10 microlitres de solution de fibrille entre les extrémités remplies de cire des deux capillaires. Couvrez la boîte de Petri pour protéger l’échantillon de la poussière et laissez-le s’évaporer toute la nuit.

Ensuite, sceller la plaque pour aider à maintenir un environnement de séchage contrôlé. Pour aligner les fibrilles amyloïdes dans un capillaire en verre, fixez une seringue de 1 millilitre avec un tube en caoutchouc à l’extrémité large d’un capillaire en verre silicifié de 0,7 millimètre de diamètre. Aspirez 2 à 3 centimètres de suspension fibrilaire dans le capillaire.

Scellez une extrémité du capillaire avec de la cire fondue et laissez l’autre extrémité ouverte pour permettre l’évaporation. Disposez le capillaire verticalement et laissez-le sécher jusqu’à ce qu’un disque séché se forme. Pour aligner les fibrilles en tapis ou en film fin, placez un échantillon de fibrille à haute concentration sur une lame en verre et couvrez avant de les faire sécher à l’air pendant 24 heures.

Montez soigneusement le paquet de fibrilles sur une tête goniométrique et orientez-le de façon à ce que le faisceau de rayons X traverse le faisceau. Si vous utilisez un échantillon de tapis de fibrilles, orientez-le de façon à ce que le faisceau de rayons X traverse le bord du tapis. Examinez l’échantillon sous un microscope optique équipé d’un polariseur croisé pour observer la biréfringence.

Positionnez l’échantillon dans le faisceau de rayons X en fonction de la présence d’un faisceau fibreur, d’un tapis ou d’un disque. Collectez un motif de diffraction à l’aide d’un équipement à rayons X interne ou du rayonnement synchrotron. Pour effectuer une analyse des données, téléchargez le fichier dans le logiciel d’analyse des motifs de diffraction CLEARER.

Naviguez dans Diagramme de diffraction et Réglage de diffraction pour entrer les réglages de diffraction, y compris la taille des pixels, la source de rayons X et la distance échantillon/détecteur. Cliquez sur Traitement d’image et Rotation pour faire pivoter l’image de diffraction afin que le méridien soit vertical. Utilisez le module de centrage en naviguant dans Motif de diffraction et en cliquant sur Image centrale pour centrer l’image.

Définissez les axes méridien et équateur. Sauvegardez l’image centrée pour une analyse ultérieure. Ensuite, spécifiez un angle approprié le long du méridien et de l’équateur.

Cliquez sur Motif de diffraction puis sur le module Moyenne radiale pour générer un graphique de la position du signal de diffraction. contre l’intensité. Naviguez jusqu’au module Peak Find depuis le menu Motif de diffraction pour mesurer et produire automatiquement le signal de diffraction.

Ajustez la largeur de recherche maximale pour détecter les signaux réels sans bruit. Utilisez l’option zoom et mesure pour vérifier la position du signal de diffraction en utilisant la recherche de pic. Explorez les dimensions potentielles des cellules unitaires à l’aide du module d’optimisation des cellules unitaires.

Saisissez les estimations initiales basées sur de forts signaux équatoriaux et définissez les indices minimum et maximum pour la recherche cellulaire. Calculez les dimensions potentielles des cellules unitaires et comparez les positions prédites des signaux de diffraction avec les réflexions observées. Sélectionnez la cellule unitaire qui correspond le mieux aux données et à l’échantillon.

Pour construire des modèles moléculaires, réalisez des arrangements 3D des peptides dans une configuration en feuille bêta qui correspond à la cellule unité déterminée. Assurez-vous que tous les composants liés à la symétrie sont inclus. Ensuite, cliquez sur Simulation de diffraction suivie de Structures et Générateur de chaîne de structures et chargez le modèle PDB.

Attribuez l’axe de la fibre et de la poutre, saisissez les dimensions de la cellule unitaire puis vérifiez les collisions stériques. Naviguez dans Simulation de diffraction et cliquez sur Simulation de diffraction de fibre pour télécharger les coordonnées PDB dans le module de simulation de diffraction de fibre. Saisissez la direction de l’axe de la fibre, l’orientation du faisceau, les dimensions de la cellule unitaire, la source de rayons X et les réglages du détecteur, puis cliquez sur Simuler pour lancer la simulation.

Assurez-vous que l’axe du faisceau est perpendiculaire à l’axe de la fibre. Ensuite, allez dans Fichier et cliquez sur Enregistrer sous pour enregistrer les paramètres de simulation en fichiers html pour une modification ultérieure. Sauvegardez le motif de diffraction simulé au format RAW ou sous forme de fichier TIFF.

Comparez le motif simulé avec le motif de diffraction expérimental. Mesurez les signaux de diffraction simulés en utilisant le même flux d’analyse. Enregistrez et comparez ces valeurs avec des données expérimentales.

Les micrographies électroniques ont montré une forte densité de fibrilles amyloïdes sur la grille, adaptées à la préparation d’un échantillon de fibres de rayons X. Les fibres alignées sur le cadre extensible produisaient un motif caractéristique de diffraction croisée-bêta avec une réflexion méridienne à 4,76 angströms et des réflexions équatoriales résultant de la longueur de la chaîne, de l’espacement des feuilles et de la taille du protofilament. Un motif idéalisé de diffraction croisée bêta a démontré que les réflexions méridiennes et équatoriales correspondent à des espacements répétitifs le long des axes fibreux.

Un motif de diffraction bien centré était symétrique, avec des pics équatoriaux et méridiens qui se chevauchaient en position. Les pics de diffraction étaient automatiquement détectés et listés à l’aide d’une analyse de détection de pics. Les pics de diffraction détectés ont été utilisés pour identifier des dimensions plausibles de cellules unitaires.

Un modèle structurel a été préparé à partir de la cellule élémentaire identifiée et visualisé avant la simulation de diffraction. Les données de diffraction simulées générées à partir du modèle structurel proposé ont montré un accord raisonnable avec le motif de diffraction expérimental, tant dans les positions de réflexion que dans les intensités relatives. La superposition de motifs de diffraction simulés et expérimentaux a également démontré l’alignement des réflexions correspondantes.

Un alignement correct de l’échantillon est crucial car il détermine la qualité des données de diffraction et les informations obtenues à partir de celles-ci. Ce travail permet la modélisation structurelle à résolution atomique et l’intégration avec d’autres techniques structurales, telles que l’AFM, pour permettre des structures moléculaires détaillées.