In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Notre travail révèle comment VCP ou p97 agit comme un défenseur cytosolique contre de multiples agents pathogènes différents. Cela libère le potentiel du VCP ou du p97 pour des applications thérapeutiques et des stratégies de bio-ingénierie. En plus de la biochimie de routine, la microscopie à super résolution, la cryo EM, la cryo ET sont utilisées pour déterminer comment ces effecteurs de l’hôte s’organisent sur le pathogène pour les détruire.

Pour commencer, cultiver la pneumonie de streptococcus est six souches sérotype deux pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone dans le milieu levureux Todd Hewitt. Inoculez une partie de la culture nocturne en 10 parties de milieu de levure Todd Hewitt frais, puis incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,4. Ensuite, mélangez 900 microlitres de culture de streptocoque pneumonie avec 600 microlitres de glycérol à 50 % et stockez le stock de glycérol à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, décongelez un nouveau stock de pneumonie de streptocoque à moins 80 degrés Celsius et inocularez-le complètement en cinq millilitres de milieu à levure Todd Hewitt. Prenez environ 10 à la puissance de sept cellules de pneumonie streptococcus. Pour bien laver les cellules, resuspendez les bactéries dans le tampon de réaction et centrifugez à 21 000 G pendant cinq minutes à température ambiante.

Re-suspendez la pellete avec un lysat de cellules mammifères de 549. Ensuite, ajoutez de l’ubiquitine purifiée et un triphosphate d’adénosine millimolaire et faites couver le mélange pendant une à deux heures à 27 degrés Celsius. Ensuite, lavez les bactéries une fois avec un tampon de réaction contenant une urée molaire, suivi de deux lavages supplémentaires avec uniquement le tampon de réaction.

Fixez les bactéries avec du paraformoldéhyde à 1 %. Après fixation, incubez les cellules avec du PBS, contenant un milligramme par millilitre de glycine pendant 15 minutes. Ensuite, lavez-le deux fois avec du PBS.

Préparez un mélange de réaction en combinant l’ubiquitine avec d’autres composants nécessaires dans le tampon de réaction. Ajustez le volume total du mélange de réaction à 100 à 150 microlitres. Résuspendez les bactéries dans le mélange réactionnel contenant l’enzyme ubiquitine, puis faites couver la suspension pendant deux heures à 27 degrés Celsius.

Après avoir lavé les bactéries trois fois avec un tampon de réaction contenant de l’urée, fixez-les avec 1 % de paraformodéhyde. Après fixation, incubez les cellules avec du PBS, contenant un milligramme par millilitre de glycine pendant 15 minutes. Ensuite, incubez l’échantillon à 3 % BSA pendant une heure à 27 degrés Celsius, puis lavez l’échantillon deux fois avec du PBS.

Resuspendez les bactéries ubiquitinées dans une solution primaire d’anticorps, préparée à des concentrations plus élevées que celles généralement utilisées dans les tests d’immunofluorescence. Puis écubez pendant une heure à 27 degrés Celsius. Après avoir lavé les bactéries deux fois avec PBS, resuspendez-les dans l’anticorps secondaire correspondant conjugué avec Alexa Fluor 488 et Alexa Fluor 555.

Maintenant, coulez environ 10 à 20 microlitres de l’échantillon bactérien marqué sur une lame en verre et mélangez cinq à dix microlitres de support de montage avec ou sans DAPI. Placez une feuille de couverture sur l’échantillon et utilisez du papier mouchoir pour étaler tout excès de liquide. Combinez six micromolaires VCP p97 avec une micromolaire NPLOC4 et une micromolaire UFD-1.

Ajustez le volume du mélange de réaction à environ 90 microlitres, en utilisant un tampon de réaction, puis faites couver sur glace pendant deux heures. Ensuite, ajoutez un à deux millimolaires d’adénosine triphosphate au mélange réactionnel contenant p97 UFD-1, NPLOC4. Ajoutez ensuite cela à 10 à la puissance de sept cellules de pneumonie de streptococcus ubiquitinées, et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Immédiatement après le traitement, prélèvez une aliquote de 10 microlitres dans le mélange de réaction et effectuez une dilution en série. Placez 10 à 20 microlitres de chaque dilution sur des plaques d’infusion cérébrale et cardiaque. Évaluez les unités formant des colonies entre les points de temps zéro et deux heures.

Calculez le pourcentage de viabilité bactérienne en divisant le nombre d’UFC à deux heures par le nombre d’UFC à zéro heure et en multipliant par 100. Une ubiquitination significative de streptococcus pneumoniae a été observée lorsqu’elle était traitée soit par lysat cellulaire de mammifère, soit par un système enzymatique E-1, E-2, E-3 reconstitué. Le signal d’ubiquitination était absent dans le témoin et nettement diminué lorsque le streptococcus pneumoniae ubiquitiné a été exposé à OTUB1, confirmant la modification polyubiquitine liée à K48.

Une analyse du profil de raies a montré un chevauchement complet entre l’ubiquitine et les signaux bactériens, confirmant leur co-localisation spatiale. La reconstruction tridimensionnelle a confirmé le chevauchement spatial des signaux d’ubiquitine et de streptococcus pneumoniae. Le type sauvage p97, combiné à ses cofacteurs, UFD1 et NPLOC4, a réduit la viabilité bactérienne à 10 à 20 % après deux heures, que l’ubiquitination ait été réalisée par lysat cellulaire ou par un système enzymatique purifié.

Aucune réduction de la viabilité bactérienne n’a été observée lorsque l’ubiquitination a été omise, lorsque p97 a été inactivé par la chaleur, ou lors de l’utilisation du mutant p97, E57 8Q, catalytiquement inactif, confirmant que l’ubiquitination et le p97 actif sont essentiels à la destruction bactérienne. Notre étude ouvre la porte à la manière dont les ligases ubiquitine E3 de l’hôte modifient différents agents pathogènes et étudient les mécanismes effecteurs pour éliminer les menaces infectieuses. Nous visons ensuite à explorer comment le p97 ou VCP est régulé, et à le concevoir davantage pour augmenter son activité antibactérienne.