Procédure d’échantillonnage basée sur le fil rouge phénol pour les lipidomiques du liquide lacrymal non ciblé dans la découverte de biomarqueurs

Nous avons mis en place une méthode plus standardisée et facile à utiliser, basée sur le fil rouge de phénol, afin d’aider à obtenir des profils lipidomiques de larmes reproductibles pour la découverte future de biomarqueurs de larmes. Le défi actuel est que les bandes de Schirmer irritent tandis que les capillaires présentent des variables opératrices dans la collecte des larmes. Cela entrave la rapportabilité expérimentale et les comparaisons inter-études.

Pour commencer, portez des gants et désinfectez soigneusement le poste de travail afin d’éviter toute contamination de l’échantillon. Tenez le fil rouge phénol à l’extrémité opposée au crochet plié, en veillant à ne pas toucher la région du crochet plié. Demandez au sujet de diriger son regard vers la direction nasale supérieure.

Ensuite, tirez doucement vers le bas de la paupière du sujet, et insérez le fil rouge phénol, le crochet plié placé dans la conjonctive palpébrale temporale inférieure près du coin externe de l’œil. Maintenant, demandez au sujet de fermer doucement les yeux et d’incliner légèrement la tête vers l’avant pour empêcher le fil rouge phénol de toucher la peau du visage. Tirez à nouveau vers le bas de la paupière du sujet et retirez doucement le fil rouge phénol, évitant le contact avec la région échantillonnée.

Notez la longueur de la région rouge échantillonnée. Et avec des pinces stériles, transférez la PRT dans un nouveau tube d’échantillon. Maintenant, étiquetez et bouchez correctement le tube d’échantillon.

Si la longueur échantillonnée est inférieure à 50 millimètres, demandez au sujet de se reposer une à trois minutes, puis répétez la collecte du liquide lacrymal avec le même œil. Placez chaque PRT nouvellement échantillonné dans un tube d’échantillonnage séparé. En utilisant du méthanol et des lingettes en papier propres, nettoyez soigneusement les gants et les pinces pour éliminer les résidus de larmes ou les contaminants.

Ensuite, laissez-les sécher complètement à l’air libre. Scellez tous les tubes d’échantillon avec du parafilm et stockez-les immédiatement à moins 20 degrés Celsius pour un stockage temporaire ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pré-lavez les microciseaux et les pinces avec du méthanol avant de traiter les fils rouge phénol.

Coupez l’extrémité tordue du crochet environ les trois premiers millimètres de chaque fil rouge phénol. Découpez la région échantillonnée jusqu’à la face du colorant rouge phénol en morceaux de deux millimètres et collectez ces segments avec un tube de microcentrifugation propre de 1,5 millilitre tolérant aux solvants organiques. Jetez l’extrémité tordue du crochet et la zone indésirable du PRT.

Placez les échantillons sur de la glace pour maintenir une température basse avant l’extraction. Ajoutez maintenant 232 microlitres de méthanol de qualité spectrométrie de masse glacée à chaque échantillon et faites passer un vortex pendant 15 secondes pour bien mélanger. Sonicez les échantillons dans un nettoyant ultrasonore pré-refroidi pendant 15 minutes.

Ajoutez ensuite 774 microlitres de méthyléther tert-butylique de qualité HPLC et 194 microlitres d’eau déionisée à chaque échantillon. Retournez à Vortex pendant 15 secondes pour bien mélanger les solvants. Sonicez à nouveau les échantillons dans un nettoyant ultrasonore pré-refroidi pendant encore 15 minutes.

Après la sonication, incubez les échantillons dans un thermomélangeur réglé à quatre degrés Celsius avec des secousses à 1 200 tours par minute pendant huit heures. Puis laissez reposer le mélange à température ambiante sans être dérangé pendant 10 minutes. Centrifugez les mélanges à 10 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après centrifugation, assurez-vous que les mélanges sont visiblement séparés en deux phases liquides distinctes. Collectez soigneusement 700 microlitres de la phase organique supérieure contenant des lipides et transférez-les dans un nouveau tube de microcentrifuge pré-refroidi de 1,5 millilitre. Éliminez la phase aqueuse inférieure, qui contient des résidus de méthyl tert-butyl et de méthanol comme déchets chimiques dangereux.

Séchez les extraits lipidiques à l’aide d’un concentrateur SpeedVac réfrigéré réglé à quatre degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, conservez les extraits lipidiques séchés à moins 20 degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Préparez le mélange de solvant méthanol-chloroforme en mélangeant du méthanol avec du chloroforme dans un rapport volume de un pour un.

Reconstituez les extraits lipidiques séchés à l’aide de 50 microlitres du mélange de solvant méthanol-chloroforme glacé. Sonicez la solution reconstituée dans un nettoyant ultrasonore pré-refroidi pendant 15 minutes. Maintenant, centrifugez les extraits lipidiques reconstitués à 14 000 G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Transférez soigneusement 40 microlitres du surnageant obtenu dans un flacon en verre autoéchantillonneur équipé d’un insert en verre. Bouchez fermement le flacon avec un capuchon ouvert du septum non fente pour le préparer à l’analyse par spectrométrie de masse en tandem en chromatographie liquide. En utilisant des critères stricts, 773, 890 et 1 025 espèces lipidiques uniques ont été identifiées dans les groupes d’échantillons réplicatif un, réplicatif deux et trois réplicés respectivement.

Le mode ion positif a identifié 1 302 espèces lipidiques avec 26 % de grade A, 13,2 % de grade B et 60,8 % de grade C. Le mode ion négatif a identifié 257 espèces lipidiques avec environ 8,2 % d’identifications de grade A, 22,9 % de grade B et 68,9 % de grade C. Malgré les variations liées au stockage, 394 espèces lipidiques uniques ont été identifiées de manière cohérente dans les trois ensembles d’échantillons.

Le coefficient de variation inter-sujets sur trois visites était de 21,5 % en mode positif et de 31,3 % en mode négatif. Ce protocole répond à l’absence d’un flux de travail standardisé pour l’analyse lipidomique des déchirures reproductibles et peut améliorer la comparabilité entre les études. Notre méthode basée sur la PRT minimise les irritations, permet une collecte rapide des déchirures et réduit la variabilité des opérateurs.

Nos recherches futures valideront les biomarqueurs lipidomiques des déchirures dans de grandes cohortes et intégreront la multiomique pour des diagnostics personnalisés.