Name: Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Découvrez l'imagerie de cellules vivantes pour surveiller la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose. Cette méthode utilise LysoTracker et des billes de dextran pour observer en temps réel les changements d'intégrité et de pH lysosomaux.

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<ol><li>Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development and diseases.</a> Genes Dev. 32, 327-340 (2018).</li>
<li>Kang, K., Park, C., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Necroptosis at a glance.</a> J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).</li>
<li>Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+pathways+of+apoptotic%2C+necroptotic%2C+pyroptotic%2C+and+ferroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death.</a> Mol Cell. 84, 170-179 (2024).</li>
<li>Zhang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3%2C+an+energy+metabolism+regulator+that+switches+TNF-induced+cell+death+from+apoptosis+to+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis.</a> Science. 325, 332-336 (2009).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Cho, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+assembly+of+the+RIP1-RIP3+complex+regulates+programmed+necrosis+and+virus-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.</a> Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+is+a+key+receptor+interacting+protein+3+downstream+component+of+TNF-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cell+death+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cell death at a glance.</a> J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).</li>
<li>Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+cell+death%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges.</a> Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).</li>
<li>Alu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lysosome+in+regulated+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">The role of lysosome in regulated necrosis.</a> Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).</li>
<li>Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1-associated+lysosomal+permeabilization+is+cathepsin+B+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).</li>
<li>Vanden Berghe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+necrosis+and+secondary+necrosis+converge+on+similar+cellular+disintegration+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features.</a> Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+polymerization-induced+lysosomal+membrane+permeabilization+promotes+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis.</a> Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).</li>
<li>Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+mice+are+resistant+to+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+hepatocyte+apoptosis+and+liver+injury%3A+implications+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications.</a> Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+quantification+of+lysosomal+membrane+permeabilization%3A+a+hallmark+of+lysosomal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death.</a> Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).</li>
<li>Barral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+to+analyze+lysosome+morphology%2C+positioning%2C+motility+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function.</a> Traffic. 23, 238-269 (2022).</li>
<li>Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+detecting+lysosome+quantity+and+membrane+permeability+in+acute+myeloid+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines.</a> STAR Protoc. 5, 103309(2024).</li>
<li>Ferrari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+quality+control+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases.</a> Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).</li>
<li>Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+stress+in+cardiovascular+diseases%3A+therapeutic+potential+of+cardiovascular+drugs+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions.</a> Biomedicines. 13, (2025).</li>
<li>Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lysosomes+in+human+disease%3A+from+basic+research+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).</li>
<li>Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).</li>
<li>Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+phosphatase+PGAM5+functions+at+the+convergence+point+of+multiple+necrotic+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways.</a> Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).</li>
<li>Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+live-cell+fluorescence+imaging+conditions+to+minimize+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity.</a> J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).</li>
<li>Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+lysosomal+membrane+permeabilization+using+acridine+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange.</a> Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).</li>
<li>Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+selective+elimination+of+damaged+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes.</a> Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cellules HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Cellules du cancer du côlon</td></tr><tr><td>Plat à fond en verre de 35 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à CO2</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Billes vertes de Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, fluorescéine, 10 000 MW, anionique, lysine réparable</td></tr><tr><td>Eagle Medium Modifié (DMEM) de Dulbecco</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp ;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rouge DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Immersion à l’huile de type HF</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et Streptomycine (P/S) & nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac mimétique (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catalogue</td><td>B4653</td><td>Concentration finale, 1 mM</td></tr><tr><td>The Brick&nbsp ;</td><td>Services d’imagerie de la vie</td><td>13685</td><td>Contrôleur de CO2 à mélangeur de gaz</td></tr><tr><td>Le Cube</td><td>Services d’imagerie de la vie</td><td>CBO2A</td><td>Microscopes à chambre de contrôle de température</td></tr><tr><td>Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-& alpha - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Concentration finale, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Concentration finale, 20 mM</td></tr></tbody></table>

imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

Les procédures décrites dans ce protocole permettent l’acquisition d’images de cellules vivantes à l’aide de la microscopie confocale pour surveiller la PML en temps réel. La figure 1 illustre une représentation schématique du protocole expérimental, du placage des cellules à l’acquisition d’images. Le jour 0, 5 000 cellules HT-29 ont été mises en boîte et incubées pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO2. Après 24 h (jour 1), les cellules ont été incubées avec des billes de dextran marquées à la fluorescéine (25 μg/mL) pendant 24 h supplémentaires dans les mêmes conditions. Ces billes sont internalisées par l’endocytose et le trafic vers les lysosomes, où elles s’accumulent et apparaissent sous forme de ponctués brillants. Le jour 2 (jour de l’expérience), les cellules ont été traitées avec un colorant LysoTracker sensible au pH (1 μM) pendant 2 h à 37 °C et 5 % de CO2. LysoTracker concentre et présente une forte fluorescence dans les compartiments acides, tels que les endosomes tardifs et les lysosomes. Trente minutes avant l’imagerie, le système de microscope confocal a été mis sous tension et stabilisé, y compris les contrôleurs de température, de gaz et d’humidité, comme décrit à l’étape 4 du protocole. La chambre d’imagerie a été assemblée, comme le montre la figure 2. Les lasers de 488 nm (vert) et de 555 nm (rouge) ont été utilisés.
Après l’incubation avec LysoTracker, les cellules ont été soigneusement lavées trois fois avec du PBS, et 2 ml de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S ont été ajoutés. La plaque a été transférée au microscope et une goutte d’huile d’immersion a été appliquée sur l’objectif d’immersion dans l’huile 63x/1,40 NA. L’intensité du laser et les niveaux de bruit de fond ont ensuite été ajustés pour optimiser les conditions d’imagerie, comme décrit à l’étape 5.5. du Protocole. Nos premières images ont confirmé la présence de ponctués stables du Lysotracker et de dextran marqué à la fluorescéine, indiquant des lysosomes intacts (Figure 3). Les images de base ont été acquises avant T/S/Z et utilisées comme contrôle. Aucun véhicule n’a été utilisé.
Après avoir établi les paramètres initiaux d’imagerie et de microscopie, la plaque a été renvoyée dans la hotte à flux laminaire, et 1 mL de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S, contenant 100 ng/mL de TNF-α (T), 500 nM de SMAC mimétique (S) et 100 μM Z-VAD-FMK (Z) a été ajouté. L’imagerie s’est poursuivie sur le microscope confocal en utilisant le paramètre d’acquisition d’imagerie décrit à l’étape 6 du protocole. Comme le montre la figure 3, la vidéo supplémentaire S1 et la vidéo supplémentaire S2, la diminution progressive de la fluorescence de LysoTracker dans les cellules traitées T/S/Z a servi d’indicateur précoce de changement lysosomal. Cette perte a été suivie d’un efflux de dextran marqué à la fluorescéine des lysosomes dans le cytosol (décalage ponctué à diffus), indiquant une LMP. À 8 h, presque tout le signal du Lysotracker a disparu, cependant, de nombreuses cellules conservaient encore des points verts avec un signal vert cytosolique, suggérant que la perte du gradient de pH lysosomal précède la libération complète de LMP et de cargaison.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Représentation schématique du protocole expérimental. (Créé en BioRender.com) Initialement, 5 000 cellules ont été plaquées (0 h) et incubées pendant 24 h ; après cela, des billes de dextran (25 μg/mL) ont été ajoutées et incubées pendant 24 heures supplémentaires. À 48 h, LysoTracker (1 μM) a été ajouté et incubé pendant 2 h. Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS (étape 1), suivies de l’ajout de 2 ml de DMEM frais complété par 10 % de FBS et 1 % de P/S (étape 2). Les paramètres de microscopie ont été ajustés (étape 3) et les cellules ont été traitées avec du TNF-α (T), un mimétique SMAC (S) et un inhibiteur de la pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z) (étape 4), avant l’acquisition d’images de cellules vivantes (étape 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Schéma de la configuration de la chambre d’imagerie. (A) Le porte-échantillon, (B) la chambre d’incubation de gaz et (C) le couvercle supérieur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Images représentatives des cellules HT29 avant et après le traitement T/S/Z. Les cellules ont été colorées avec des billes rouges Lysotracker et vertes Dextran et traitées avec du TNF-α (T), un mimétique SMAC (S) et un inhibiteur de la pan-caspase Z-VAD-FMZ (Z). Barre d’échelle : 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Film supplémentaire S1 : Time-lapse de cellules HT29 incubées avec des billes vertes de Dextran et traitées avec du T/S/Z. Les cellules ont été surveillées pendant plus de 6 heures pour évaluer la réponse cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>
Film supplémentaire S2 : Time-lapse de cellules HT29 incubées avec LysoTracker red et traitées avec T/S/Z. Les cellules ont été surveillées pendant plus de 6 heures pour évaluer la réponse cellulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.</a>

Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

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La mitophagie est le principal mécanisme du contrôle de la qualité mitochondriale. Cependant, l’évaluation de la mitophagie in vivo est entravée par le manque de tests quantitatifs fiables. Un protocole d’observation de la mitophagie dans les cellules vivantes est présenté ici à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable de cellules et d’un colorant lysosome fluorescent rouge.

Visualisation de la mitophagie avec des colorants fluorescents pour les mitochondries et le lysosome

Ce protocole fournit des instructions pour déclencher et surveiller la pexophagie médiée par Stub1 dans les cellules vivantes.

Surveillance de la pexophagie médiée par Stub1

Ce protocole décrit un mécanisme d’utilisation de la lumière corrélative et de la microscopie électronique pour visualiser l’interaction des mitochondries et des lysosomes marqués avec mEosEM et APEX2, respectivement.

Microscopie corrélative à la lumière et à l’électronique bicolore pour la visualisation des interactions entre les mitochondries et les lysosomes

Découvrez l'imagerie de cellules vivantes pour surveiller la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose. Cette méthode utilise LysoTracker et des billes de dextran pour observer en temps réel les changements d'intégrité et de pH lysosomaux.

Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

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