Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie cellulaire vivante pour surveiller la perméabolisation de la membrane lysosomale lors de la nécroptose à l’aide de sondes fluorescentes détectant les changements dans l’intégrité et l’acidification de la membrane lysosomal. Le défi sur le terrain est de caractériser la dynamique des organites endommagés lors du processus de mort cellulaire, et de définir précisément comment ces dommages doivent entraîner ou contribuer à la mort cellulaire. Pour commencer, placez 5 000 cellules dans deux millilitres de milieux DMEM supplémentés en antibiotiques dans un plat à fond en verre stérile.

Placez le plat dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, puis faites couver les cellules toute la nuit. Ajoutez 20 microlitres de billes vertes de dextrane à 25 microgrammes par millilitre dans un milieu DMEM frais complété avec antibiotiques pour les diluer. Retirez l’ancien substrat du plat et remplacez-le par deux millilitres de médium DMEM complété contenant du bœuf.

Placez le plat dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone, puis incubez pendant 24 heures pour permettre l’internalisation des billes en lysosomes. Ajoutez maintenant deux microlitres d’une solution d’origine millimolaire LysoTracker à deux millilitres de milieux DMEM frais. Remplacez l’ancien substrat par cette solution de teinture.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures. Allumez les composants du système confocal en allumant l’ordinateur personnel, le microscope, l’alimentation du scanner, la puissance du laser, l’émission laser et l’alimentation Leica. Activez les contrôles environnementaux, y compris le contrôleur de température, appelé le Cube, et le contrôleur du mélangeur de gaz au dioxyde de carbone, appelé le Brick.

Ouvrez l’apport en dioxyde de carbone et en oxygène. Réglez le contrôleur de température à 37 degrés Celsius. Réglez le régulateur de gaz et d’humidité à 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’humidité.

Assemblez la chambre d’imagerie. Après la coloration, lavez les cellules trois fois avec deux millilitres de PBS, puis ajoutez deux millilitres de média DMEM frais et complété. Appliquez de l’huile d’immersion sur la lentille objective avant l’imagerie.

Montez la parabole sur l’étage du microscope. Ajustez l’intensité du laser jusqu’à 3 % mais pas plus de 5 % Ensuite, ajustez le gain du détecteur dans le logiciel du microscope pour optimiser le signal. Minimisez l’arrière-plan en ajustant la barre de contraste.

Acquérir des images de base des cellules non traitées, qui servent de condition témoin. Retournez la plaque dans la hotte à flux laminaire et ajoutez un antibiotique DMEM d’un millilitre complété avec des inducteurs de mort cellulaire. Dans le logiciel d’acquisition, réglez le mode sur XYT, formatez 512 par 512, vitesse à 400, zoomez à trois, moyenne ligne à un, accumulation de ligne à trois, accumulation d’images à un, intervalle de temps à trois minutes, durée à huit heures, et activez l’autofocus.

Cliquez sur démarrer pour commencer l’acquisition en accéléré. Les premières images ont confirmé la présence de punctes stables de LysoTracker et de dextran marqué à la fluorescéine, indiquant la présence de lysosomes intacts avant traitement. Quatre heures après le traitement par TSZ, la fluorescence de LyoTracker a été visiblement réduite, tandis que le dextrane a commencé à montrer une distribution cytosolique diffuse, indiquant une perméabilisation initiale de la membrane lysosomal.

Huit heures après le traitement, le signal de LysoTracker avait presque complètement disparu, tandis que de nombreuses cellules conservaient des points verts dextran avec un signal cytosolique vert diffus. Nous démontrons que la perméabolisation de la membrane lysosomale peut être directement visualisée dans une cellule vivante en induction nécroptotique. Ce protocole démontre que la combinaison des billes LysoTracker et dextrane permet un suivi simultané du pH lysosomique et de la libération de la cargaison en temps réel.

Un élément important pour faire progresser ce protocole d’image cellulaire vivante est sa capacité à surveiller en temps réel un léger changement de pH et une perméabilisation de la membrane lysosomal, capturant des événements dynamiques qui sont manqués par l’analyse des points d’extrémité tels que la cytométrie en flux et la coloration monocouche.