Name: Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Découvrez les méthodes biochimiques pour caractériser la GFAP et ses mutations causant la maladie d'Alexander. Ce protocole permet d'étudier l'assemblage des filaments et les modifications post-traductionnelles.

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<table><tbody><tr><td>Solution acrylamide/Bis 30 % 37,5:1</td><td>Biorad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFAP</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-ubiquitine</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>Clone FK2</td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-26S XP</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroamphénicol</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sephrose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>Colorant bleu Coomassie</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>Grille en cuivre</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX Micro ultracentrfuge</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéiseur de dounce</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>UR</td><td>TDT</td><td></td></tr><tr><td>Souche pLysS d’E. coli BL21(DE3)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactif ECL</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HiRes S</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>Colonne Q HiTrap</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (LB Agar)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>Médium LB (LB Broth)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Honeywell</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie NGC</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima XE-90</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>Polyehtylénémine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S55S Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S80AT3 Rotor</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 anti-souris IgG&nbsp ;</td><td>Biorad</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 anti-lapin IgG&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission H-7700)</td><td>Hitachi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’uranyle</td><td>Sciences du microscope électronique & nbsp ;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>urée</td><td>Honeywell</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

Pour étudier comment les mutations responsables de l’AxD affectent les propriétés d’assemblage du GFAP, nous avons produit des protéines recombinantes chez des bactéries en utilisant un système d’expression basé sur le PET. Nous détaillons les protocoles pour exprimer et purifier GFAP, en prenant WT GFAP comme exemple. Après l’induction IPTG (Figure 1A, voie 2), le GFAP a été purifié par un processus en trois étapes impliquant la préparation du corps d’inclusion (Figure ...

Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

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Research

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Nous décrivons une technique pour la préparation de clarifier humaine homogénats corticaux, la séparation des protéines par SDS-PAGE, la récupération d'antigène et immunoblot avec un anticorps dirigé contre le peptide Aß. En utilisant ce protocole, nous avons constamment de détecter Aßi monomère et multimère dans le tissu cortical des humains à la pathologie d'Alzheimer.

Détection SDS-PAGE/Immunoblot de multimères de Aßi tissu cortical humain homogénats utilisant l&#39;antigène démas

Un protocole d'extraction de la protéine en utilisant un tampon commun urée / thiourée / SDS pour le tissu cérébral des souris humain et permet indentification de protéines par 2D-DIGE et leur caractérisation ultérieure par un mini 2DE immunoblot. Cette méthode permet un pour obtenir des résultats plus fiables et reproductibles à partir de biopsies humaines et des modèles expérimentaux.

Protéines consensus dérivé du cerveau, Protocole d&#39;extraction pour l&#39;étude de l&#39;homme et du protéome murin cerveau en utilisant deux 2D-DIGE et Mini 2DE Immunoblotting

En utilisant la microscopie à force atomique en combinaison avec la technologie de biopanning, nous avons créé un système de biopanning négatif et positif pour acquérir des anticorps contre les variantes de protéines spécifiques à la maladie présentes dans n’importe quel matériel biologique, même à de faibles concentrations.  Nous avons réussi à obtenir des anticorps dirigés contre des variantes de la protéine TDP-43 impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.

Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement de l’alpha-synucléine (α-syn) de plus en plus insoluble/agrégée à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Grâce à l’utilisation de tampons à la résistance détergente croissante et à des techniques d’ultracentrifugation à grande vitesse, les propriétés variables de l’agrégation α-syn dans les tissus malades et non malades peuvent être examinées.

Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens

Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

Analyse des anomalies induite par la β-amyloïde sur Structure de caillot de fibrine par spectroscopie et microscopie électronique à balayage

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

Ce protocole décrit une méthode pour suivre les trajectoires individuelles de vieillissement du cerveau à travers un programme de don de cerveau et une caractérisation appropriée des cerveaux. Les donneurs de cerveau sont impliqués dans une étude longitudinale à long terme comprenant des évaluations multidimensionnelles en série. Le protocole contient une description détaillée du traitement du cerveau et une méthodologie diagnostique précise.

Abbiategrasso Brain Bank Protocol for Collecting, Processing and Characterizing Aging Brains

Deux méthodes connexes sont décrites pour visualiser les événements subcellulaires nécessaires à la transmission synaptique. Ces protocoles permettent de surveiller en temps réel la dynamique de l’afflux de calcium présynaptique et de la fusion de la membrane des vésicules synaptiques à l’aide de l’imagerie cellulaire vivante de neurones cultivés in vitro .

Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans les modèles de sclérose latérale amyotrophique

Nous présentons ici un protocole sur la façon de préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir de cortex de rat pour l’imagerie vidéo time-lapse de Ca2+ intracellulaire pour la recherche sur la physiopathologie de la sclérose latérale amyotrophique dans le modèle de rat hSOD1G93A .

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

Cette méthode de purification biochimique avec analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse facilite la caractérisation robuste des noyaux de fibrilles amyloïdes, ce qui peut accélérer l’identification de cibles pour la prévention de la maladie d’Alzheimer.

Purification biochimique et caractérisation protéomique des noyaux de fibrilles amyloïdes du cerveau

Découvrez les méthodes biochimiques pour caractériser la GFAP et ses mutations causant la maladie d'Alexander. Ce protocole permet d'étudier l'assemblage des filaments et les modifications post-traductionnelles.

Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie (Vidéo) | JoVE Journal

Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie

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