Purification des trophoblastes extravilleux ^HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

Ce protocole est conçu pour purifier les trophoblastes humains primaires des tissus placentaires humains afin d’étudier leurs propriétés fonctionnelles et immunologiques lors d’une grossesse saine et dans des conditions pathologiques. Ce protocole offre donc une plateforme reproductible pour surmonter certaines limites antérieures liées au travail avec les trophoblastes extravilleuses humaines primaires, notamment leur viabilité. Ce protocole est donc vraiment optimisé pour améliorer leur viabilité et leur pureté.

Pour commencer, prélève un échantillon de placenta humain. Placez le placenta avec le côté fœtal vers le haut afin que le site d’insertion du cordon soit visible. Décollez manuellement l’amnion de la membrane latérale vers le site d’insertion du cordon ombilical et retirez-le.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper et jeter l’amnion. Coupez la membrane choriodéciduale en bandes de deux pouces à partir de la base du placenta vers le haut tout en maintenant chaque bande attachée au placenta. Placez la bande de membrane choriodéciduale sur deux doigts, avec le côté décidual orienté vers le haut.

Avec une paire de pinces courbées stériles à pointe, grattez doucement la décidua parietalis maternelle du chorion. Prélever la cadua parietalis dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS pour l’isolement des lymphocytes. Ensuite, collectez la membrane chorionique dans un tube conique séparé de 50 millilitres contenant 20 millilitres de milieu de lavage A. À l’aide de ciseaux, découpez la membrane chorionique à l’intérieur du tube de 50 millilitres en morceaux de plus petits que deux millimètres carrés.

Jetez le médium de lavage A du tube. Lavez le mouchoir à plusieurs reprises avec du PBS jusqu’à ce que le surnageant devienne clair. Pour la dissection placentaire, placez le placenta avec le côté maternel vers le haut et retirez les caillots sanguins.

À l’aide de ciseaux stériles, coupez des morceaux de plaque basale du placenta tout en évitant les zones nécrotiques, calcifiées ou ischémiques. Placez la pièce de base de la cadua sur les doigts avec les villosités tournées vers le haut. Ensuite, utilisez des ciseaux pour retirer soigneusement les villosités afin d’obtenir une membrane de deux à trois millimètres, ne laissant qu’une fine couche de villosités.

Collectez le tissu de la base de la feuille dans un tube conique de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS. Ensuite, coupez le mouchoir en morceaux de plus de deux millimètres carrés. Ensuite, jetez le PBS du tube.

Lavez la feuille de la caduque basale à plusieurs reprises avec du PBS jusqu’à ce que le surnageant soit clair sans sang visible. Ensuite, il faut diviser 15 millilitres de suspension tissulaire en deux tubes coniques de 50 millilitres. Remplissez tous les tubes de PBS.

Centrifugez les tubes à 200G pendant une minute et versez le surnageant. Ajoutez 150 millilitres de cocktail enzymatique tiède pour digestion tissulaire dans une bouteille en verre de 300 millilitres. Ajoutez 30 millilitres de membrane chorionique à la bouteille.

Ajoutez 20 millilitres de DMEM/F-20 tiède et 80 millilitres de cocktail enzymatique tiède pour digestion tissulaire dans deux bouteilles en verre séparées de 300 millilitres. Ajoutez ensuite 7,5 millilitres de decidua basalis dans chaque bouteille. Faites couver les bouteilles dans un bain-marie.

Secouez toutes les bouteilles toutes les trois à quatre minutes pendant les 15 minutes d’incubation. Après la digestion, filtrez le tissu à travers des tamis métalliques d’une taille de maille de 40. Ensuite, ajoutez le médium B pour rincer les tissus et dissoudre le matériau gélatineux.

Transférez les tissus non digérés dans les bouteilles en verre et répétez la digestion. Ensuite, filtrez les suspensions cellulaires à travers un filtre de 100 micromètres dans des tubes coniques de 50 millilitres marqués. Gardez séparées les cellules des première et deuxième digestions.

Ensuite, centrifugez la suspension à 650G pendant huit minutes. Jetez le surnageant. Combinez des granulés du même type de tissu et du même numéro de digestion dans un seul tube.

Ensuite, complez le volume avec le médium de lavage B jusqu’à 25 millilitres. Ajoutez 12 millilitres de ficoll à quatre tubes coniques de 50 millilitres marqués avec le type de tissu et le numéro de digestion. Superposez soigneusement la suspension à cellules sur le ficoll.

Ensuite, centrifugez à 800 G pendant 20 minutes à température ambiante sans casse. Aspirez soigneusement la couche cellulaire à l’interface du milieu ficoll et transférez-la dans des tubes nettement étiquetés. Ensuite, remplissez les tubes avec le médium B, centrifugez à 650 G pendant huit minutes, puis remettez les pellets.

Placez les granulés en suspension dans des tubes de tri cellulaires stériles activés par fluorescence, marqués par type de tissu et numéro de digestion. Ajoutez des anticorps anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC et anti-EGFR1 BV711. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante dans le noir.

Après avoir lavé et resuspendu les cellules dans le milieu B, passez-les immédiatement à travers un passoire de 40 micromètres. Triez le taux de trophoblaste extravilleux positif EGFR positif au HLAG négatif CD45 dans des tubes contenant un milieu de culture EVT d’un millilitre A. L’analyse de cytométrie à flux des marqueurs de lignée a montré une culture primaire de trophoblaste extravilleuse viable jusqu’au quatrième jour. Des images représentatives de microscopie optique du trophoblast extravilleux positif au niveau chorionique primaire et de la base de la Decidua basalis HLAG ont été capturées après 24 heures, 48 heures et 72 heures de culture.

Des molécules HLAC polymorphes et co-inhibitrices immunosuppressives exprimées par un trophoblast extravilleux. Le trophoblaste extravilleux a augmenté l’expression de HLAC,-L1,-L2 et HLA-E, mais n’a pas augmenté l’expression de PVR et B7H3 lors de la co-culture avec des lymphocytes activés pendant 72 heures. Aucune augmentation des décès extravilleux par trophoblaste n’a été observée après co-culture avec des lymphocytes activés.

Ce protocole permet donc aux scientifiques, les scientifiques, d’utiliser des trophoblastes extravilleux primaires pour une grande variété d’essais. L’avantage réside dans la grande viabilité qui permet une analyse en culture cellulaire, culture à froid, cytométrie en flux, protéomique, transcriptomique, en utilisant ces trophoblastes extravilleux à haut rendement très viables. L’un des aspects les plus importants de notre protocole est que vous devez utiliser des matériaux placentaires frais.

On ne peut pas les réfrigérer. Les trophoblastes adorent mourir, alors veuillez obtenir les tissus placentaires dès que possible après l’accouchement, de préférence dans les deux heures suivant l’accouchement, et gardez-les à température ambiante en permanence. C’est crucial pour obtenir un trophoblaste extravilleux très viable.

Certaines des méthodes plus avancées et innovantes pour lesquelles on peut utiliser ces trophoblastes primaires sont la culture cellulaire à long terme. Vous pouvez donc les utiliser pour établir des cultures cellulaires primaires de quatre jours. Ainsi, les cellules seront viables jusqu’à 96 heures, ce qui est assez long, et cela permet de faire des cultures à froid avec des cellules immunitaires, comme les cellules T et les cellules NK.

L’autre innovation est aussi que vous pouvez les utiliser pour établir des lignées cellulaires de type trophoblaste en utilisant les méthodes décrites d’abord par Aoki, et que nous avons également utilisées pour établir des types cellulaires proliférants à long terme que vous pouvez utiliser pour l’édition du génome et d’autres tests de culture à plus long terme. Donc, utiliser ces méthodes innovantes, y compris la culture cellulaire à long terme, peut vraiment vous aider à concevoir des cultures mécanistes à long terme où l’on peut appliquer l’édition du génome, les gènes knock-out, knock-in, les protéines, sur-exprimer certains de ces trophoblastes pour obtenir beaucoup plus de détails mécanistes sur la façon dont ces trophoblastes renforcent la tolérance, ou permettre l’immunité et une cytotoxicité accrue lorsqu’ils interagissent avec les populations immunitaires.