Name: Préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hPTM2) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Découvrez une méthode automatisée d'analyse des modifications post-traductionnelles des histones à résolution unicellulaire utilisant un marquage isotopique duplex. Ce protocole permet de profiler quantitativement l'hétérogénéité chromatinienne avec haute sensibilité.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro ; Pointes de pipet à large calibre en L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro ; Pointes de pipet à large calibre en L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>Plaque PCR à 384 puits Lo Bind&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur à vide à 96 puits</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitre, grade Optima LC-MS/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Feuilles de plaque PCR adhésives</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Solution de stock d’étiquettes pour le vrac.</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, Mass Sspect Grade</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité en culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALS</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation</td></tr><tr><td>DMSO, anhydre</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Solution de stock pour les étiquettes</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eagle’s Medium modifié (DMEM) de Dulbecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique 98 % et ndash ; 100 % pour LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>La solution salée équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Pure)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Eau de qualité HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxylamine 50&nbsp ;p/ % dans H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Détergent n-Dodécyl-bêta-Maltoside (DDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre de masse Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 % de Solution aqueuse de qualité EM</td><td>Sciences de la microscopie électronique</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (revêtement de type 2)</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS), 10x, pH 7,4, sans RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde de Pierce (DMSO), grade LC-MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet à pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride propionique &ge ; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride propionique-d10 & ge ; 98 atomes % D, &ge ; 99 % (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Lames en verre revêtu SciCHIP H1</td><td>SCIENION</td><td>/</td><td>Le numéro de catalogue est accompagné d’une citation</td></tr><tr><td>Concentrateur à vide SpeedVac (plaques à 96 puits)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Cagoule stérile</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Coloration verte des cellules mortes SYTOX, pour la cytométrie en flux</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), sans phénol rouge</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Bain marie</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Pour démontrer l’application de notre flux de travail de protéomique d’histones unicellulaire utilisant notre système, nous avons analysé des sphéroïdes de cellules HepG2/C3A traitées avec 5 mM de butyrate de sodium pendant 24 heures. Après l’acquisition de LC-MS/MS, les données brutes ont été traitées avec EpiProfile pour un marquage léger (anhydride propionique) et lourd (anhydride propionique-d10), obtenant des données normalisées représentant les abondances des peptides et des marques d’histones. Le package QuantQC R...

Préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Ce protocole décrit un flux de travail entièrement intégrée pour caractériser histone modifications post-traductionnelles par spectrométrie de masse (MS). Le flux de travail comprend histone purification à partir de cultures de cellules ou de tissus, histone dérivatisation et la digestion, l'analyse de MS en utilisant la chromatographie et des instructions pour l'analyse des données de liquide nano-flux. Le protocole est conçu pour l'achèvement dans les 2 - 3 jours.

Flux de travail complet pour l&#39;analyse des histones modifications post-traductionnelles utilisant la spectrométrie de masse Bottom-up: De Histone Extraction à l&#39;analyse des données

Ce manuscrit décrit des méthodes pour l'application de la technologie des micro-aigres peptidiques au profilage spécifique des anticorps qui reconnaissent les histones et leurs modifications post-traductionnelles.

Analyse de la spécificité d&#39;anticorps d&#39;histone avec des microarrays de peptides

Le but de cet article est de fournir un guide complet et systématique à l’épuration efficace des histones H3 et H4 et la quantification des résidus d’histones acétylées.

Purification de H3 et H4 histones et la Quantification des histones acétylées marques dans les cellules et les tissus cérébraux

Ce flux de travail décrit la performance de l’enrichissement rentable et temporel de multiples modifications post-traductionnelle (PTM) de protéines simultanément pour l’analyse protéomique globale quantitative. Le protocole utilise l’enrichissement ptM de niveau peptidique avec de multiples anticorps conjugués, suivi d’une analyse de spectrométrie de masse d’acquisition indépendante des données pour obtenir des connaissances biologiques sur le crosstalk PTM.

Enrichissement simultané d’affinité de deux modifications post-traductionnelle pour la quantification et la localisation des sites

Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.

Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq

Ce protocole décrit comment un système de culture cellulaire tridimensionnel peut être utilisé pour modéliser, traiter et analyser les modifications de la chromatine dans un état quasi physiologique.

Quantification au niveau global des modifications post-traductionnelles des histones dans un modèle de culture cellulaire 3D de tissu hépatique

Ce travail décrit un protocole pour la quantification des modifications globales des histones par cytométrie en flux intranucléaire dans des microglies cérébrales isolées. L’ouvrage contient également le protocole d’isolement de la microglie qui a été utilisé pour la collecte de données.

Quantification des modifications post-traductionnelles des histones globales à l’aide de la cytométrie en flux intranucléaire dans la microglie cérébrale isolée de souris

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Ce protocole permet une extraction efficace d’histones de divers échantillons cliniques pour une analyse ultérieure des modifications post-traductionnelles par LC-MS/MS. En facilitant la détection robuste des modifications clés des histones, il constitue un outil précieux pour un profilage épigénétique complet dans de grandes cohortes cliniques.

Extraction d’histones à partir d’échantillons cliniques pour le profilage épigénétique par spectrométrie de masse

Des variantes génétiques chez le membre humain de la famille Spindline 4 (SPIN4) ont récemment été identifiées chez des patients atteints de prolifération osseuse, un trouble du développement nouveau. Un protocole et de nouveaux résultats décrivant l’identification biochimique des histones modifiés dans le contexte des nucléosomes en tant que substrats de liaison au SPIN4 sont présentés.

Identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (SPIN4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs

Cette étude présente un protocole multiome spatial Trekker–CUT&amp;Tag combinant le codage à barres spatial direct d’une section tissulaire avec l’analyse multiome unicellulaire. Cette approche permet simultanément un profilage spatial de l’expression génique par une seule cellule et la modification de l’histone H3K27ac, offrant des perspectives mécanistes sur la régulation génique dans le contexte de la microanatomie tissulaire.

Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

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Préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hPTM2)

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