Préparation automatisée d’échantillons pour l’analyse multiplexée des modifications post-traductionnelles de histones unicellulaires (sc-hPTM2)

Nous faisons progresser la protéomique unicellulaire avec une méthode de multiplexage automatisée pour étudier l’hétérogénéité globale de la chromatine pour les modifications post-traductionnelles. Ce qui rend ce protocole difficile, c’est la préparation protéomique à l’échelle picogramme, le marquage multiplex, ainsi que la résolution de peptides histoniques modifiés combinatoires complexes. Pour commencer, reconstituez les cellules du carcinome hépatocellulaire de l’hépatite G2/C3A à une concentration finale de 200 à 500 cellules par microlitre dans des PBS glacés.

Réglez la largeur d’impulsion et la tension de commande de chaque buse aux valeurs fournies par le fabricant. Pour une efficacité maximale du capteur, assurez-vous que le décalage Z entre les deux buses diffère de moins de 50 micromètres. Identifiez la position de contact optimale pour chaque buse et comparez les relevés de hauteur Z dans l’onglet de configuration de la buse.

Pour le schéma de multiplexage en tuplex, chargez une seule culasse sur le porte-culasse dans la hotte puis transférez-la à l’instrument. À l’aide d’une pipette, on insuffle 150 microlitres de DMSO de qualité LCMS dans un nouveau tube PCR. Placez-le en position deux de la station de lavage avec le bouchon du tube tourné vers la porte de l’instrument.

Commence la partie DMSO. Obtenir une chute stable une fois après que le DMSO a été aspiré. Notez le changement dans la transparence du PDC.

Il peut être nécessaire d’augmenter la tension. Vérifiez la stabilité en effectuant une vérification du volume de chute. Effectuez le réglage de l’assistant caméra de tête pour aligner la caméra.

Distribuez le DMSO et laissez l’instrument se nettoyer automatiquement sur les buses et capturer des images sur toutes les lames pour le contrôle qualité. Examinez ces images pour vérifier une gouttelette DMSO uniforme sur chaque diapositive et pour vérifier la présence de gouttelettes manquantes ou hors cible. Après avoir aspiré la suspension de la cellule, ouvrez la cellule dans un module, effectuez une capture de fond puis exécutez la routine de cartographie pour définir la zone d’éjection.

Effectuez l’analyse puis faites un gate des particules pour sélectionner les cellules en fonction de la taille et de l’allongement. Préparez maintenant un mélange maître de digestion frais dans de l’eau de qualité LCMS. Dégazez la solution avec une pompe à vide pendant 10 minutes sur de la glace.

Après avoir distribué le mélange digestif sur les lames, laissez l’instrument rincer automatiquement les buses et photographiez chaque lames. Examinez les images pour vérifier que chaque gouttelette reçoit uniformément le mélange digestif. Incubez les lames à température ambiante toute la nuit pour effectuer la digestion.

Après avoir commencé la course d’évaporation et la digestion nocturne, inspectez les images. Si les gouttelettes sont suffisamment sèches, arrêtez la fuite. Sinon, cliquez sur continuer et séchez encore cinq minutes.

Pour le marquage, préparez d’abord des solutions standard pour la dérivation multiplexée des histones. Après la distribution, laissez l’instrument rincer automatiquement les buses et photographiez chaque lame. Examinez les images pour confirmer une distribution uniforme et un placement correct des gouttelettes sur toutes les lames.

Après l’incubation, dispensez la solution d’hydroxylamine pour trempe. Pour récupérer l’échantillon, sélectionnez la série dans l’onglet principal, puis lancez la série dans l’onglet exécution. Une fois le ramassage terminé, examinez les images pour vérifier toute erreur.

Une fois le micro terminé, retirez le couvercle de la plaque du micro. Ensuite, sécher les échantillons à basse température dans un concentrateur sous vide. Pour l’acquisition de données, programmez la méthode de chromatographie liquide haute performance.

Réglez l’expérience MS deux pour contenir des fenêtres d’isolement de 50 de surcharge de masse, une dissociation de collision haute énergie de 27 % et un objectif de contrôle automatique de gain de 1000 %. Couvrez la plaque d’un tapis de joints en caoutchouc et placez-la à l’intérieur de l’échantillonneur automatique. Après avoir obtenu les fichiers bruts, vérifiez brièvement le chromatogramme puis exécutez les données brutes dans la version 2.1 d’EpiProfile. Consultez la table de sortie des abondances normalisées des PTM des histones et utilisez-la pour les analyses en aval.

Les 20 premiers peptidoformes H3 d’histones ont été quantifiés, montrant leurs abondances relatives dans des conditions témoins et traitées au butyrate de sodium. L’acétylation de H3K9 et celle de H3 K14 ont toutes deux montré une abondance relative plus élevée lors du traitement au butyrate de sodium. Alors que l’acétylation H3 K9, l’acétylation K14 semblait encore plus enrichie dans les cellules traitées.

Les niveaux totaux d’acétylation ont augmenté après un traitement au butyrate de sodium, les cellules traitées montrant une distribution d’erreur plus large comparée aux témoins qui témoignent de l’hétérogénéité plus élevée captée au niveau de la cellule unique. La quantification des modifications histoniques simples et coexistantes a démontré que les états d’acétylation combinatoire étaient les plus fortement affectés par le butyrate de sodium. La dispersion plus large des cellules traitées au butyrate de sodium indiquait une hétérogénéité biologique accrue entre les cellules individuelles au sein des sphéroïdes.

Ce protocole comble l’écart dans la recherche épigénétique en permettant aux scientifiques d’étudier les états de la chromatine en solution unicellulaire. Ce flux de travail permet la préparation d’échantillons à haut débit, le multiplexage d’échantillons et la spectrométrie de masse impartiale pour produire des données épigénétiques unicellulaires sensibles et quantitatives. De futures recherches exploreront comment la régulation de la chromatine modifie des états pathologiques tels que le cancer, les maladies métaboliques et le vieillissement.