Le test d’hémostase de Nimègue : mesure simultanée fluorogénique de la génération de thrombine et de plasmine dans un seul puits

Mes recherches portent sur la mesure de l’hémostasie secondaire et de la fibrinolyse ensemble pour mesurer l’équilibre hémostatique global. La plupart des tests actuels évaluent les composants isolés de la coagulation ou de la fibrinolyse. Cet essai mesure les deux processus simultanément dans un même sais.

Pour commencer, activez le lecteur de plaques à fluorescence et laissez-le s’équilibrer à 37 degrés Celsius. Configurez les paramètres du filtre dans le logiciel en fixant le nombre de paires de longueurs d’onde à deux. Réglez la longueur d’onde d’excitation à 355 nanomètres pour la thrombine et 485 nanomètres pour la plasmine.

Ensuite, réglez la longueur d’onde d’émission à 460 nanomètres pour la thrombine et 525 nanomètres pour la plasmine. Ensuite, réglez le type de plaque sur une microplaque noire Greiner à fond plat à 96 puits. Naviguez jusqu’à la zone de lecture et définissez la disposition des plaques en utilisant un maximum de 20 puits par plaque.

Configurez les paramètres PMT et optique en réglant le gain PMT à 200 volts et le nombre de flashes par lecture à six. Ensuite, allez dans Minutage pour confirmer les réglages de synchronisation avec un temps total d’exécution d’une heure, neuf minutes et 30 secondes, un intervalle de 30 secondes. Naviguez dans Shake pour confirmer un shake de trois secondes avant la première lecture.

Naviguez dans Plus de paramètres pour vous assurer que l’ordre de lecture est défini sur Colonne. Configurez les paramètres de transfert composé avant lecture en réglant le nombre de transferts composés à un et le volume initial à 120 microlitres. Vérifiez que la hauteur de la pipette est de 130 microlitres, le volume de 20 microlitres, le débit d’un microlitre par seconde, et le point temporel de 14 secondes.

Dans la section Source du composé, confirmez le format de la plaque composée à 96 puits, et choisissez spécifiquement l’option Beckman 96 2,3 millilitres. Confirmez les paramètres de disposition des pointes de pipette en sélectionnant les bonnes colonnes. Rendez-vous maintenant dans les colonnes Astuces Composées et sélectionnez les bonnes colonnes.

Réglez la température du vibrateur à microplaques à 37 degrés Celsius et vérifiez la température avant utilisation. Ensuite, réglez l’intensité de secousse à 1 100 tours par minute. Ensuite, décongelez le plasma du patient et le plasma normal dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant jusqu’à 10 minutes.

Mélangez soigneusement les échantillons de plasma et vérifiez le dégel complet sans cryoprécipitat visible. À l’aide d’une pipette, ajoutez 80 microlitres de plasma patient ou de plasma normal en pool dans les puits présélectionnés, en utilisant une pointe de pipette fraîche pour chaque échantillon. Ensuite, préparez le mélange de substrat en mélangeant 48 microlitres de céphaline avec 48 microlitres de facteur tissulaire.

Ajoutez à cela un tampon de chlorure trisodium de 240 microlitres, puis une pipette de substrat de thrombine de 96 microlitres et de substrat plasmique de 48 microlitres. Pipettez 20 microlitres du mélange substrat dans chaque puits. Serre la main après.

Insérez maintenant la microplaque dans le lecteur de plaques à fluorescence et laissez-la s’équilibrer à 37 degrés Celsius pendant plusieurs minutes. Combinez le tampon au chlorure trisodique, le tampon chlorure de calcium au chlorure trisodique et l’activateur de plasminogène tissulaire pour préparer le réactif de départ. Vortex soigneusement pour mélanger.

Pipette le mélange de réactifs de départ dans toutes les rangées de la colonne composée. Insérez la plaque contenant le mélange de réactifs de départ dans le tiroir à source et commencez la mesure de fluorescence. Enregistrez les signaux de fluorescence toutes les 30 secondes pendant 70 minutes.

Maintenez la plaque à 37 degrés Celsius tout au long de la mesure. Pour l’analyse des données, exportez les données de fluorescence cinétique sous forme de tableau contenant les points temporels et les valeurs de fluorescence par puits. Calculez la première dérivée et tracez les courbes de génération enzymatique pour chaque puits afin de visualiser la génération de thrombine ou de plasmine au fil du temps.

Le test d’hémostasie a permis une mesure simultanée et résolue dans le temps de la génération de thrombine et de plasmine afin d’assurer une évaluation intégrée de la coagulation et de la fibrinolyse. Plusieurs paramètres peuvent être déduits de la courbe de génération de la thrombine, notamment le temps de latence, la hauteur maximale et le potentiel de la thrombine. Des délais plus longs, des hauteurs de pic plus basses et des potentiels de thrombine réduits indiquent une production de thrombine altérée.

La courbe de génération de la plasmine fournit également plusieurs paramètres, notamment le temps de lyse de la fibrine et la hauteur du pic de la plasmine. Des temps de lyse de fibrine plus courts et des hauteurs de pic plus élevées reflètent une génération de plasma améliorée. Les courbes de génération de thrombine et plasma de trois témoins sains et de plasma normal et groupé ont montré un timing reproductible de pic et d’extrémité de pointe, servant de profils de référence pour une fonction hémostatique normale.

Chez un patient présentant un facteur V de 3 %, la génération de thrombine était complètement absente. Cependant, la production de plasma a légèrement augmenté. Le patient présentant une activité de facteur V de 44 % a montré une diminution de la génération de thrombine avec un délai prolongé et une diminution de la hauteur maximale tandis que la génération plasmatique est restée dans la plage normale.

En cas de carence en Alpha-2-antiplasmine, la génération de plasma a augmenté avec la diminution de l’activité de l’Alpha-2-antiplasmine. Le patient homozygote présentant 23 % d’activité présentait un début précoce de génération de plasmine, un temps de lyse de fibrine plus court et un pic plasmatique plus élevé. Ces altérations ont également été observées chez le patient hétérozygote présentant 73 % d’activité, bien qu’elles soient moins marquées.

Le test d’hémostasie est bien adapté à la recherche sur les carences rares en facteurs de coagulation, les troubles fibrinolytiques et les effets des médicaments hémostatiques. Les principaux défis sont la standardisation de la technique et la normalisation des résultats afin d’améliorer la comparabilité entre les salles et les laboratoires. Les travaux futurs pourraient se concentrer sur l’automatisation du test et le développement d’adaptations pour la compatibilité avec le sang total ou le plasma riche en plaques.