Développement d’un nouveau modèle de fixation interne pour les fractures radiales chez le rat : évaluation de la cicatrisation des fractures et isolement des ganglions de la racine dorsale

Les fractures du radi sont très répandues à l’échelle mondiale et constituent une cause majeure de fractures de l’os long des extrémités. Le modèle de fracture radiale chez le rat est crucial pour étudier la cicatrisation des fractures, le dépistage de médicaments et l’évaluation des biomatériaux en recherche orthopédique. Comme le rayon des rats est relativement mince, les plaques et vis en acier actuellement utilisées en pratique clinique ne conviennent pas au traitement des fractures radiales chez les rats.

Pour surmonter cette limitation, le protocole combine de manière innovante la suture et la fixation par aiguille en titane, établissant un modèle stable de fracture radiale pour la recherche sur la fixation interne. Dans le protocole, nous avons également présenté l’utilisation du système d’imagerie micro-CT d’animaux vivants pour clarifier la cicatrisation des fractures chez les rats. Nous avons également montré l’extraction et la culture du DRG dans le modèle de fracture du rat, qui sera utilisé pour étudier le mécanisme de la lésion nerveuse et de la réparation dans les fractures.

Les instruments chirurgicaux pour fractures de rat comprennent la lame du scalpel, le manche du scalpel, les ciseaux opératoires, le porte-aiguilles, les pinces hémostatiques et les pinces tissulaires dentées. Le rat mâle de Sprague Dawley, âgé d’environ 8 semaines et pesant environ 200 grammes. Anesthésiez le rat à l’aide d’une machine d’anesthésie au gaz isoflurane et maintenez l’anesthésie ventilatoire pendant toute la chirurgie.

Maintenez la température de la salle d’opération à 28 °C. Placez le rat en position latérale. Exposez le membre avant droit et rasez les poils avec une tondeuse à cheveux. Placez un drap stérile et enroulez un garrot autour du membre antérieur proximal droit pour réduire les saignements chirurgicaux.

Préparez la peau en alternant trois fois l’alcool et les gommages à la bétadine. Réalisez une incision longitudinale de 1,5 cm sur le côté radial dorsal de l’avant-bras droit. Séparez les espaces musculaires et exposez complètement le rayon du membre antérieur droit.

Utilisez des ciseaux d’opération pour couper le rayon et créer une fracture transversale. La direction des ciseaux forme un angle de 90 degrés avec le rayon. Prenez une aiguille en titane de 0,8 mm de diamètre et 10 mm de long, et insérez-la dans la fracture radiale le long de son axe longitudinal.

Fixez le rayon et l’aiguille en titane avec une suture. La suture était nouée par trois nœuds consécutifs, et l’aiguille en titane était fixée au rayon par quatre points interrompus. Suture la couleur de la peau de l’excédent de suture et ferme le bois.

Désinfectez la peau avec des gommages au bétadine. Couvrez la plaie avec une gaze stérile et fixez-la avec des bandages. Le rat a repris conscience après anesthésie et son état s’est bien rétabli.

Anesthésiez le rat à l’aide d’une machine d’anesthésie au gaz isoflurane. Placez le rat en position allongée dans la chambre de scan. Ajustez la position des membres et de la tête pour centrer la zone de balayage cible dans le champ de vision et maintenir une ventilation et une anesthésie continues tout au long de la procédure.

Poussez le lit fixe dans la chambre de balayage et fermez la porte de la chambre. Les paramètres de balayage micro-CT étaient définis comme suit : mode de balayage : standard, temps d’exposition : deux minutes, champ de vision : 72 mm, taille du voxel : 144 m, kilovolt : 90 ; micro-ampères : 88, filtre : 3D - soft. Les données de balayage sont automatiquement transmises au logiciel, et une image CT tridimensionnelle est générée.

Séparez les tissus cibles. Exportez les images traitées. Sectionner la colonne vertébrale, retirer les corps vertébraux de C1 à C7.

Coupez la colonne cervicale le long des lignes médianes antérieures et postérieures, divisées en moitiés gauche et droite. Utilisez des pinces de tissus dentés pour soulever la DRG, soulevez-la doucement puis utilisez des ciseaux opératoires pour couper les fibres nerveuses. Transférer les DRG extraits dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL avec un milieu d’extraction.

Mettre sur la glace. Aspirez lentement et jetez le milieu d’extraction. Ajoutez 1 mL de solution mixte digestive et enzymatique.

Digérez dans un bain-marie à 37°C pendant 60 à 70 minutes. Pipeter une quantité appropriée de la solution active sur la fibronectine dans une boîte de Petri et enrobez-la dans un incubateur à 37 °C pendant une heure. Après la digestion, aspirez, puis jetez la solution enzymatique mixte fonctionnant.

Collectez le filtrat, centrifugez à 70 x g pendant 8,5 minutes. Après centrifugation, aspirez et jetez le surnageant dans le tube centrifugeuse. Ajoutez 1 mL de milieu complet pour resuspendre le précipité.

Enlève la boîte de Petri. Jetez la solution active sur la fibronectine et lavez-la deux fois avec du PBS. Inoculez les cellules dans une boîte de Petri, ajoutez 1 mL de milieu complet.

Placez-les dans un incubateur à température constante à 37 °C avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 8 à 12 heures. L’imagerie micro-CT a confirmé la mise en place réussie de modèles de rats de fracture radiale et de modèle de fixation interne pour les fractures du radi chez le rat. 20 jours après la modélisation, l’analyse micro-CT des rats SD du groupe modèle fracture a révélé un pronostic favorable.

La formation de callosités a été observée en train de relier les extrémités de la fracture, avec une fusion progressive et une obliteration progressive de la ligne de fracture, ce qui est cohérent avec la phase précoce de l’union osseuse. Les images montraient une ligne de fracture floue dans la région modélisée, suggérant que le tissu osseux au site de fracture avait en grande partie cicatrisé. Au 5e à 6e jour après l’isolement de la DRG, les cellules neuronales présentent une exposition cytoplasmatique étendue.

À ce stade, l’ensemble des corps cellulaires neuronaux et leurs synapses environnantes sont clairement distinguables. La microscopie à immunofluorescence a été utilisée pour photographier les cellules neuronales le 6e jour de la culture. Comme montré à la Figure 9, la bêta-III-tubuline a été présentée comme une fluorescence verte.

Les cellules positives à la bêta-III-tubuline, incluant à la fois les corps cellulaires DRG et les axones, ont été colorées en vert, et la fluorescence bleue représente les noyaux des neurones colorés par DAPI. Les rats constituent un modèle classique pour étudier le mécanisme de guérison des fractures en raison de leur fond génétique clair et de leur cycle reproductif court. Cependant, le petit diamètre du radi d’environ 1 à 1,5 mm rend impossible la correspondance avec un dispositif de fixation interne de qualité clinique, limitant fortement son utilité dans la recherche sur la cicatrisation nerveuse-os.

En réponse à ce problème, cette étude a proposé de manière innovante la méthode combinée de fixation interne de la suture en titane par aiguille. La logique centrale est de remplacer la fixation rigide des vis par la ligature flexible des sutures, qui pourrait réduire la lésion nerveuse iatrogène et offrir un environnement mécanique stable. Ce protocole offrait de la répétabilité et une standardisation pour la construction du modèle.

Les points de suture et les aiguilles en titane sont utilisés pour la fixation interne dans les modèles de fracture radiale chez le rat. La cicatrisation des fractures est évaluée par micro-CT. Les neurones DRG primaires sont isolés et cultivés après des examens de cicatrisation des fractures.

Dans le protocole, nous combinons de manière innovante des points de suture et des aiguilles en titane pour une fixation interne stable dans un modèle de fracture radiale chez le rat. La cicatrisation des fractures a été évaluée par micro-CT, et les neurones DRG primaires ont été isolés et cultivés pour des investigations ultérieures.