Améliorer les écrans CRISPR-Cas9 dans les cellules CAR T : une méthode affinée pour la préparation des bibliothèques

Nos recherches portent sur l’utilisation des approches de dépistage CRISPR pour identifier les cibles et améliorer l’efficacité des thérapies par cellules CAR T. Les défis actuels de l’expérience incluent la réalisation de méthodes de laboratoire reproductibles dans les approches de dépistage CRISPR. Pour commencer, ajoutez une quantité prédéterminée de bibliothèque virale CRISPR de Lenta à une plaque à 24 puits contenant des lymphocytes T.

Ajoutez le polycerveau à une concentration finale de huit microgrammes par millilitre. Mélangez doucement pour assurer une répartition uniforme. Centrifugez les cellules à 700 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius pour effectuer la spin-fection.

Après centrifugation, retirez soigneusement la plaque de la centrifugeuse. Remplacez le milieu par un nouveau milieu de croissance des lymphocytes T. Après six heures, ajoutez le vecteur viral CAR lenta à une multiplicité d’infection de trois.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre jours. Une fois l’incubation terminée, collectez les cellules CAR T. Laver une fois avec du PBS.

Ensuite, colorez les cellules avec de l’iodure de propidium d’acradine orange, et comptez-les dans un compteur de cellules fluorescentes. Préparez une solution de 4 micromolaires de Cas9 dans un tampon d’électroporation. Resuspendez cinq fois 10 à la puissance six piles CAR T dans 50 microlitres de solution cas9.

Ensuite, pipettez 50 microlitres de la suspension de la cellule dans chaque puits d’une bande de cuvete multi-puits sans former de bulles. Enlevez toute bulle visible en faisant doucement glisser une pointe de pipette le long des bords du puits. Utilisez le programme d’expansion des lymphocytes T trois pour nukleefecter les cellules CAR T.

Placez les cuvettes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Resuspendez les cellules nucléo-supprimées dans un milieu de croissance des lymphocytes T. Puis incubez à nouveau à 37 degrés Celsius pendant trois jours.

Comptez les cellules en utilisant une coloration à l’iodure d’acradine orange dans un compteur de cellules fluorescentes. Après avoir ajusté la densité cellulaire à dix à la puissance de six cellules par millilitre, ajoutez la puromycine à une concentration finale de 2,5 microgrammes par millilitre. Après six jours d’incubation, évaluer le pourcentage de cellules CAR positives à l’aide de la cytométrie en flux.

Ensuite, trier les populations de cellules CAR T et stocker les granulés à cellules sèches à moins 80 degrés Celsius. Extraire l’ADN génomique des échantillons à l’aide d’une méthode d’extraction d’ADN cellulaire et tissulaire. Mesurez la concentration d’ADN génomique à l’aide d’un kit de quantification de l’ADN double brin.

Ensuite, digère jusqu’à cinq microgrammes d’ADN génomique avec 20 unités des enzymes de restriction sélectionnées sur un volume total de 50 microlitres. Incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur. Le lendemain, préparez 10 millilitres de tampon d’élution contenant 10 millimolartris HCL et 50 millilitres d’éthanol frais à 70 %.

Pipeter 100 microlitres du produit digéré dans un tube contenant des billes en vortex. Pipeter pour mélanger soigneusement la suspension et incuber pendant cinq minutes à température ambiante avant de magnétiser pendant cinq minutes supplémentaires. Pendant que vous êtes sur l’aimant, jetez le surnageant et pipettez 200 microlitres de solution à 70 % d’éthanol sans déranger la pellete.

Après 30 secondes, jetez le surnageant et effectuez deux lavages à l’alcool supplémentaires. Après deux lavages, laissez sécher les billes pendant deux minutes, puis retirez-les de l’aimant. Ajoutez 40 microlitres de tampon élucien et une pipette pour resuspendre les billes.

Magnétiser la suspension pendant deux minutes, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube. Ajoutez un tampon de liaison x wash à un tube contenant un milligramme de billes magnétiques de vortex streptavidina. Pipette pour resuspendre les billes dans le tampon.

Ensuite, placez la suspension sur un aimant pendant une minute, jetez le surnageant et effectuez deux lavages supplémentaires. Après le troisième lavage, re-dépenser les billes dans deux tampons de liaison de lavage. Ajoutez ensuite cinq microlitres de primers à tirage biotinylés de 10 micromolaires au produit de digestion purifié.

Faites couver le mélange dans un bain sec à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes puis refroidissez immédiatement sur la glace pendant cinq minutes. Ajoutez un milligramme de billes magnétiques de streptavidine pré-lavées à la réaction, en veillant à ce que les billes de réaction et de streptavidine aient des volumes égaux. Incubez pendant 20 minutes à température ambiante tout en resuspendant toutes les quatre minutes.

Magnétiser les billes pendant cinq minutes, puis laver trois fois avec un tampon de liaison de lave-lavage. Enfin, resuspendez les billes contenant la cassette sgRNA liée dans 50 microlitres de tampon élucien. Préparez et amplifiez la bibliothèque d’ARNsg et séquencez-la.

Après sélection des antibiotiques, les cellules CAR T transduquées avec la bibliothèque CRISPR ont montré une survie et une prolifération continues chez les deux donneurs après le traitement à la puromycine. Les lymphocytes T non transduits et les cellules CAR T dépourvues de transduction par bibliothèque CRISPR n’ont pas montré une prolifération comparable sous sélection antibiotique et ont servi de témoins négatifs. La digestion enzymatique de restriction avec NDEL et PSPXI a généré un ADN génomique fragmenté tout en préservant la cassette d’ARN guide unique pour l’enrichissement.

Les fragments contenant des sgRNA ont ensuite été amplifiés sélectivement. Les corrélations de Pearson et Spearman ont montré que le nombre de lectures d’ARN guide unique et la complexité de la bibliothèque étaient maintenus dans les échantillons génomiques des donneurs comparés à la bibliothèque plasmidique. Une analyse robuste d’agrégation de rangs a identifié des gènes significativement enrichis ou appauvris après l’édition Cas9 chez les deux donneurs.

L’analyse d’enrichissement des voies a révélé des termes de l’ontologie génique principale associés aux régulateurs génétiques identifiés. Notre protocole offre une alternative fiable aux techniques de laboratoire existantes utilisant les approches de dépistage CRISPR. Nos résultats feront progresser le domaine en soutenant le développement de protocoles de dépistage CRISPR plus reproductibles et robustes.

Nos résultats ont ouvert la voie à l’identification des gènes et peuvent être modérés pour améliorer le phénotype et la fonction des cellules CAR T.