Essai d’immunofluorescence multiplexé pour l’évaluation spatiale des marqueurs de sénescence in vivo

L’analyse spatiale des cellules sénécentes est importante pour comprendre leur contribution à des processus tels que le vieillissement, le cancer, l’immunité et l’homéostasie des tissus normaux. La détection des cellules sénécentes repose sur le profilage de plusieurs biomarqueurs. L’imagerie immunofluorescence multiplex permet un profilage à haut débit de ces images au sein d’une seule section tissulaire.

Pour commencer, vérifiez que les sections de tissu fixées en formol, incrustées en paraffine ou FFPE, de 5 micromètres d’épaisseur, d’une taille maximale de 4 x 2 centimètres carrés, sont montées centralement sur des lames de microscopie chargées positivement et sont clairement visibles à l’intérieur de la fenêtre de visualisation du porte-lames sans cache. Effectuez les étapes de préparation de l’échantillon, soit manuellement à l’aide d’une chambre de décamouflage, soit automatiquement à l’aide d’un coloreur automatique. Placez les lames préparées dans le porte-glissière sans couvercle.

Alignez les bords supérieur et droit contre les butées métalliques. Verrouillez la culasse en place avec les deux mains en même temps pour tourner les cames en plastique en position cadenas fermée. Vérifiez que la culasse est complètement à plat et ne bascule pas dans le support.

Placez le ClickWell, insérez la chambre au-dessus de la culasse, et pincez les barres latérales à deux mains pour limiter la pression et éviter les casses. Chargez le puits à clic avec 2 millilitres de média de montage contenant 50 % de glycérol dans une solution physiologique tamponnée au phosphate via l’orifice d’entrée. Ajoutez une étiquette de code-barres sur le côté gauche de la diapositive, dans l’une ou l’autre orientation, puis procédez à l’imagerie.

Pour la sélection de régions et l’analyse d’autofluorescence, ouvrez le Mx Workflow version 4204, logiciel d’acquisition d’imagerie multiplex. Cliquez sur Outils pour sélectionner Éditeur de protocole. Dans la fenêtre contextuelle Multiplex Protocol Publisher, saisissez le nom du protocole.

Cliquez sur Créer une phase de configuration, puis sur ajouter la ronde de protocole suivant pour créer plusieurs cycles d’étiquetage de biomarqueurs. Cliquez sur Publier, puis sélectionnez OK dans la fenêtre contextuelle. Acquérez le canal Cy3 pour des images virtuelles H&E.

Cliquez sur la diapositive, puis créez un nouveau lot. Après avoir sélectionné le nom du protocole, saisissez l’ID de la diapositive. Cliquez sur Ajouter diapositive puis sélectionnez Créer un lot pour créer un flux de travail d’expérience multiplex. Ouvre le logiciel d’acquisition Cell DIVE.

Cliquez sur Charger pour charger la lame dans le microscope. Dans le menu déroulant Outils, cliquez sur l’icône de grille pour définir les régions souhaitées et utilisez l’outil Déplacer pour repositionner les régions définies. Ensuite, utilisez l’outil Dessiner pour désélectionner les champs non requis, en vous assurant que chaque champ de vision possède au moins deux champs de vision voisins pour éviter les problèmes de jonction, puis cliquez sur Enregistrer les régions.

Dans la fenêtre Workflow MX, cliquez sur Viewer QC pour ouvrir la page du visualiseur Cell DIVE et visualiser l’image tissu en grossissement 10x. Cliquez sur l’icône de correction d’image pour ajuster la luminosité de l’image et cliquez sur Soumettre le contrôle qualité pour sélectionner Passer et recharger la diapositive dans la fenêtre contextuelle. Une fois l’image rechargée, cliquez sur Ajouter ROI pour dessiner et ajuster les régions d’intérêt.

Sélectionnez les champs de vision souhaités et répétez l’ajout du ROI. Ensuite, cliquez sur Envoyer au laboratoire. Chargez la diapositive pour lancer l’acquisition de l’image en autofluorescence 20x.

Dans le menu Imaging QC, sélectionnez la case correspondant à l’identifiant spécifique de la diapositive, puis cliquez sur Viewer QC. Zoomez sur l’image chargée pour scanner les régions floues ou les artefacts. Vérifiez les images d’arrière-plan de chaque chaîne, qui seront soustraites du signal final du biomarqueur. Cliquez sur Soumettre le contrôle qualité, puis sélectionnez Passer et Sortir pour générer des images d’arrière-plan.

Avant la coloration séquentielle par biomarqueurs, centrifugez les anticorps à 13 000 G pendant une minute à température ambiante pour limiter les artefacts. Préparez la solution d’anticorps à une dilution de 1 sur 200 dans une solution sérumen tamponnée phosphate, ou PBS, contenant 0,3 % d’albumine sérique bovine, ou BSA. Retirez le support de montage en faisant des pipetages depuis le port ClickWell.

Et laver trois fois avec 2 millilitres de PBS contenant 0,01 % de Tween 20 ou PBST pendant 5 minutes. Ajoutez 350 microlitres de solution d’anticorps dans le port pour garantir une couverture complète de l’échantillon dans la chambre de coloration. Incubez pendant une heure à température ambiante.

Ensuite, faites une pipette pour retirer la solution d’anticorps depuis le port ClickWell. Et laver trois fois avec 2 millilitres de PBST pendant 5 minutes. Ajoutez 2 millilitres de support de montage.

Insérez le support ClickWell dans le microscope et chargez la lame pour commencer l’imagerie 20x du biomarqueur. Effectuez la vérification qualité de l’imagerie en utilisant l’éditeur de fusion et les options de correction d’image, puis soumettez l’évaluation de la qualité de l’image. Faites une pipette pour retirer le support de montage depuis le port ClickWell et lavez trois fois avec 2 millilitres de PBST pendant 5 minutes.

Préparez la solution d’inactivation du colorant fraîchement avant utilisation. Après avoir retiré le PBST, ajoutez 2 millilitres de solution d’inactivation de colorant pour chaque lame. Incubez pendant 15 minutes dans le porte-lames.

Faites une pipette sur la solution d’inactivation du colorant depuis le port ClickWell et lavez avec 2 millilitres de PBST pendant 5 minutes. Ajoutez 2 millilitres de support de montage et insérez le support ClickWell dans le microscope pour initier une imagerie autofluorescence 20x spécifique à chaque rond. Faites progresser le flux de travail en passant les étapes de contrôle qualité comme indiqué à l’écran une fois terminé.

Répétez la coloration séquentielle, l’inactivation du colorant et l’imagerie multiplex pour autant de marqueurs que nécessaire, puis continuez jusqu’à la fin. Utilisez le logiciel HALO pour sélectionner différents canaux afin de visualiser la localisation des marqueurs dans différentes régions du noyau tissulaire. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Image complète pour analyser les métriques quantitatives des marqueurs individuels.

Cliquez sur Résultats pour voir le nombre total de cellules dans le noyau tissulaire analysé ainsi que le sous-ensemble de cellules exprimant des marqueurs spécifiques. Comparée à la méthode automatisée basée sur le coloreur de diapositives, la méthode manuelle basée sur la chambre de décamouflage a entraîné une fréquence plus élevée d’artefacts tissulaires caractérisés spécifiquement par un décollement de tissu ainsi que par des noyaux perdus ou glissés. La quantification réalisée avec un logiciel de pathologie numérique sur le tissu pancréas représentatif a révélé que les cellules p16 positives étaient associées à des niveaux plus faibles de LB1 et inversement, démontrant un profil cohérent avec les schémas de marqueurs associés à la sénescence.

Une carte thermique normalisée Z-score illustre la distribution du phénotype de sénescence p16 positif lamin-B1 à travers divers tissus, révélant de fortes concentrations de cellules sénescentes dans le poumon, les glandes surrénales et l’hypophyse, correspondant à des niveaux élevés de p16 et une diminution de la LB1. Inversement, l’appendice, le ganglion lymphatique et la rate présentaient une faible sénescence, maintenant une expression élevée de la LB1 et une faible expression de la p16. Ce protocole permet de sonder une combinaison de biomarqueurs de sénescence, structuraux et immunitaires dans une seule lame de microscopie.

En combinant plusieurs marqueurs au sein d’un seul échantillon, une analyse spatiale de l’architecture tissulaire et de la distribution cellulaire sénescente peut être réalisée. Les applications futures incluent le profilage à grande échelle des biomarqueurs de sénescence sur plusieurs types de tissus et l’intégration avec des omiques spatiaux pour mieux résoudre l’hétérogénéité cellulaire.