Isolement des péricytes à partir de tissu cortical de souris à l’aide de FACS pour le séquençage unicellulaire

Nos recherches examinent les parasites cérébraux en se concentrant sur leurs rôles vasculaires et leurs interactions au sein de l’unité neurovasculaire afin de comprendre la fonction cérébrale. Une imagerie basse et la FACS spatiale dans un processus intestinal, la cartographie ou la fonction parasitaire au sein de la vasculature cérébrale révèlent les rôles spécifiques à la localisation et les cibles thérapeutiques. Pour commencer, vaporisez la région de la tête et du cou d’une souris euthanasiée avec 75 % d’éthanol.

À l’aide d’un scalpel, réalisez une incision médiane du cuir chevelu de l’occipital à la région frontale pour exposer le crâne. Effectuer une incision transversale antérieure aux orbites bilatérales, suivie d’incisions latérales le long des bords inférieurs du cervelet pour détacher la base du crâne. Incisez le calvaire longitudinalement le long de la suture sagittale de postérieur en antérieur.

Soulevez le lambeau crânien avec un duramater pour exposer le cerveau. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, surélevéez doucement le cerveau tout en sectionnant les nerfs optiques et la connexion de la moelle épinière de la moelle allongée. Placez délicatement le cerveau intact dans un plat de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS glacé, évitant ainsi tout dommage.

Transférez le cerveau sur du papier aluminium. Exposez l’espace subarachnoïdien. Après avoir retiré la dure-mère avec une pince, rincez-la avec la solution salée équilibrée de Hank.

Transférez le mouchoir sur du papier filtre et retirez le piamètre en roulant. Avec une lame de rasoir, coupez et jetez le bulbe olfactif, ainsi que les sections les plus caudales, puis coupez le cerveau coronalement en tranches de deux à trois millimètres d’épaisseur. Isolez le cortex cérébral le long du corps calleux.

Transférez le tissu cortical dans des ampoules contenant trois millilitres de tampon de collecte de tissu glacé. À l’aide de scalpels chirurgicaux, hachez les tissus et ampoules en fragments d’environ un millimètre par un, puis terminez le hachage en cinq minutes pour préserver la fraîcheur tissulaire. Pré-rinçez les pointes de pipette avec un tampon de collecte de tissu.

Ensuite, aspirez lentement les fragments hachés vers l’apex de la pointe tout en tenant la pipette verticalement. Expulsez doucement les fragments dans des tubes centrifugeuses pré-refroidis de 15 millilitres. Lavez les ampoules originales avec 2 % de FBS dans du sérum sérum de PBS.

Transférez le lavage dans les mêmes tubes de centrifugeuse et centrifugez à 300G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant après centrifugation. Resuspendez chaque pellet dans trois millilitres de solution active enzymatique CD.

Aliquote la suspension en trois tubes à parts égales, et ajoute une solution enzymatique supplémentaire pour atteindre un volume final de cinq millilitres par tube. Incubez les tubes dans un four d’hybridation à 37 degrés Celsius pendant 100 minutes avec un secouement orbital à 100G. Pendant l’incubation, ajoutez un millilitre de dnase, une solution à 10 millilitres de 2 % de FBS dans le PBS.

Terminez la digestion en centrifugant à 300 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, re-suspendez chaque pastille dans un millilitre de solution de dissociation tissulaire. Pipettez la solution 100 fois pour faciliter la dissociation mécanique.

Ensuite, concentrez toutes les suspensions dans un seul tube centrifugeuse de 50 millilitres. Rincez chaque tube avec deux millilitres de tampon et combinez les lavages. Après centrifugation à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et en éliminant la couche la plus haute, ajoutez 12,5 millilitres de 20 % BSA et inversez pour mélanger.

Centrifugez à 1000 G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Maintenant, collectez la pastille du fond et transférez le surnageant dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres. Resuspendez doucement avant de centrifuger à nouveau.

Resuspendez chaque pellet dans deux millilitres de 2 % de FBS dans PBS. Ensuite, combinez les deux suspensions en un seul tube. Centrifugez la suspension combinée à 300 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après avoir jeté le surnageant, re-suspendez la dernière pellete dans deux millilitres de PBS avec 2 % de FBS. Préparez quatre tubes centrifugeuses de 15 millilitres contenant quatre millilitres de solution à 22 % par appel. Posez doucement des aliquotes de 0,5 millilitres de suspension cellulaire sur chaque gradient et centrifugez à 560G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir aspiré le surnageant, re-suspendez chaque pellet dans un millilitre de tampon glucose HBSS BSA. Ensuite, on retire les suspensions dans un nouveau tube de 15 millilitres. Rincez les tubes de percol avec deux millilitres de tampon et combinez les lavages avant centrifugation à 300G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Pour la cytométrie en flux, re-suspendez le pellet dans un millilitre de tampon glucose HBSS BSA après avoir aspiré le surnadant. Ajoutez cinq microlitres de réactif bloquant les récepteurs FC et faites éclore à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, pipeter des anticorps conjugués fluorescentement à la suspension avant l’incubation.

Lavez les cellules avec six millilitres de tampon glucose HBSS BSA. Ensuite, centrifugez la suspension à 300 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir aspiré le surnageant, re-suspendez le pellet dans un millilitre de tampon.

Ajoutez 200 microlitres de solution de sept aminoactinomycines D et faites couper sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, ajustez le volume final à deux millilitres avec un tampon HBSS complété par du BSA et du glucose. Rincez la surface interne des tubes de collecte de tri avec une solution à 1 % BSA.

Aspirez l’excès de solution, en laissant exactement un millilitre de solution dans chaque tube. Stockez les tubes sur de la glace pour recevoir les cellules triées. Les cellules dissociées du tissu cérébral ont été séquentiellement déclenchées par une zone de diffusion avant et une zone de dispersion latérale afin d’exclure les débris cellulaires lors du tri par cytométrie de flux.

Les événements doubles positifs CD45 et CD41 positifs ont été exclus afin d’éliminer les cellules hématopoïétiques et les contaminants plaquettaires. Les cellules parois vasculaires CD13 positives ont été enrichies. Et les cellules apoptotiques ont été exclues en utilisant sept amino actinomycine D négative, suivies d’une sélection CD31 négative pour isoler les parasites.

Le tri par cytométrie en flux a montré que les cellules nucléées étaient responsables de 59,8 % de tous les événements. Les cellules CD13 positives ont représenté 1 % de tous les événements. Et la population finale de parasites positifs au CD13 positif au CD31 représentait 0,7 % de tous les événements.

La réduction de dimensionnalité UMAP des cellules triées a révélé six grappes majeures distinctes indiquant l’hétérogénéité cellulaire au sein de la population isolée. L’analyse de la carte thermique normalisée par Z-score a démontré que les gènes marqueurs parasites étaient fortement et principalement exprimés dans les amas zéro à trois. L’analyse des proportions de groupes a montré que les groupes zéro à trois constituaient 87,1 % de la population totale.

Alors que les marqueurs des cellules musculaires lisses étaient enrichis dans le groupe quatre à 10,14 % et les marqueurs fibroblastiques dans le groupe cinq à 2,77 %. Ce protocole permet aux chercheurs d’isoler des parasites portables de haute pureté, adaptés au séquençage unicellulaire en aval et à l’analyse fonctionnelle. Le principal défi est l’absence de marqueurs parasitaires très spécifiques, l’isolement compliqué et l’augmentation du risque de contamination séculière. Les études futures pourront se concentrer sur l’identification des marqueurs spécifiques aux parasites, permettant une amélioration de l’isolation, une caractérisation fonctionnelle plus approfondie et des investigations thérapeutiques ciblées.