Méthode standardisée pour détecter les nanotubes de tunnel dans les cellules cutanées humaines pour des applications d’ingénierie tissulaire

Nous avons développé des méthodes pour détecter et analyser de manière fiable les nanotubes de tunnel entre les cellules de la peau humaine et étudier leur rôle potentiel dans la régénération cutanée. Notre protocole est conçu pour des échantillons fixes ou pour les cellules primaires de la peau humaine. C’est utile pour la recherche liée à la biologie de la peau et à la régénération tissulaire.

Pour commencer, décongelez et cultivez les kératinocytes épidermiques humains et les fibroblastes dermiques dans des plaques de 60 millimètres contenant le milieu de croissance approprié. Compléter les cultures de kératinocytes avec Y-27632 jusqu’à une concentration finale de cinq micromolaires lors de la réanimation. Maintenez toutes les cultures à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié jusqu’à atteindre environ 80 % de confluence.

Ensuite, retirez le substrat du plat de culture. Rincez brièvement les cellules avec un millilitre de PBS pour maintenir le pH physiologique et l’osmolarité pendant le lavage. Aspirez complètement le PBS.

Ajoutez un millilitre d’EDTA à 0,05 % de trypsine et répartissez uniformément la surface cellulaire. Faites couver le plat à 37 degrés Celsius pendant 1,5 à 2,5 minutes. Resuspendez doucement les cellules en pipettant de haut en bas.

Ajoutez deux millilitres de milieu de croissance pour neutraliser la trypsine. Transférez la suspension à cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, jetez le surnageant du tube de centrifugeuse.

Résuspendez la pellete cellulaire dans un à deux millilitres de milieu et comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique. Ensuite, semez 12 000 fibroblastes dermiques ou 20 000 kératinocytes dans chaque puits d’une lame à huit puits en un volume final de 400 microlitres. Après l’ensemencement, secouez bien la chambre en croix pour répartir les cellules uniformément et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant environ 24 heures.

Après l’incubation, vérifiez si la confluence cellulaire est d’environ 80 % au microscope. Lorsque les cultures atteignent 80 % de confluence, ajoutez doucement plusieurs gouttes de solution fixative directement dans le puits de chambre pour préfixer les cellules. Incubez les cellules à température ambiante pendant quatre minutes, afin de garantir que le fixateur se propage uniformément sans perturber les cellules.

Ensuite, aspirez le préfixateur du puits et ajoutez 140 microlitres de solution fixative fraîche en un, assurant ainsi une couverture complète de la surface du puits. Incubez la lame à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, retirez le fixatif du puits de chambre et ajoutez 140 microlitres de 100 millimolaires chlorure d’ammonium pour réduire les aldéhydes résiduels.

Incubez la lame à température ambiante pendant 10 à 30 minutes. Rincez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 30 secondes chacune à température ambiante. À chaque rinçage, faites doucement une pipette sur le tampon le long de la paroi de la chambre pour éviter d’enlever les cellules ou d’endommager les nanotubes tunneliers.

Incubez les cellules avec 140 microlitres d’une dilution volume/volume 1:300 d’agglutinine de germe de blé conjugué farine Alexa dans PBS. Effectuer l’incubation dans le noir à température ambiante pendant 20 minutes pour marquer les glycoprotéines de membrane plasmatique afin de visualiser les nanotubes de tunneling dérivés de la membrane. Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant 30 secondes chacune.

Puis incubez les cellules avec 140 microlitres de conjugué de phalloïdine dilués une à 250 fois dans 1 % BSA pendant 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Après avoir lavé les cellules trois fois avec du PBS, incubez-les avec 140 microlitres de solution DAPI pendant cinq minutes à température ambiante dans l’obscurité. Enfin, ajoutez deux à trois gouttes de substrat de montage à chaque puits et faites couver l’échantillon à température ambiante pendant 20 minutes.

Conservez les lames à quatre degrés Celsius dans le noir pendant au moins 20 minutes jusqu’à l’imagerie. Dans les cultures de fibroblastes dermiques, les nanotubes tunnelants ont été observés comme de longues projections fines reliant des cellules adjacentes à des membranes colorées par l’agglutinine germinale du blé et la F-actine marquées par la phalloïde. Dans les cultures de kératinocytes épidermiques, des nanotubes tunnelants avec des protubérances caractéristiques F-actine positive ont également été observés faisant le pont entre cellules voisines.

Dans les co-cultures de fibroblastes dermiques et de kératinocytes épidermiques, des nanotubes tunnels ont été systématiquement détectés entre les fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques, visualisés par membrane et cytokératine 5. Les nanotubes tunneliers dans les co-cultures présentaient une organisation cytosquelettique diversifiée, avec des exemples ne contenant que de la F-actine, à la fois les filaments, de la F-actine avec une alpha-tubuline partielle, ou avec de faibles niveaux d’alpha-tubuline. Le principal défi est de préserver le tunnel dans les nanotubes.

Cela nécessite une fixation douce, un timing approprié et l’utilisation d’additifs fixes fraîchement préparés. Grâce à notre protocole, les nanotubes de tunnel peuvent être mesurés dans différentes conditions cellulaires afin d’explorer leurs fonctions potentielles. À l’avenir, nous marquerons les mitochondries par fluorescence pour étudier leur transfert via des nanotubes tunnel.