Essai de formation de colonie détectant la capacité proliflective des cellules d’ostéosarcome à élimination d’ARNCn

Mes recherches portent sur l’ostéosarcome et visent à étudier comment le knockdown de LncRNA influence la capacité proliférative à long terme à l’aide de tests d’information sur colonie. Pour commencer, semez 5 fois 10 à la puissance de 5 cellules d’ostéosarcome 143B dans deux bols de culture de 10 centimètres. Cultivez les cellules en DMEM complet complétées avec un sérum bovin fœtal à 10 % à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone.

Préparez les réactifs de transfection 24 heures plus tard, incluant plasmides, polyéthylenimine et le médium essentiel OptiMinium. Manipulez chaque réactif en vortex et laissez-les s’équilibrer à température ambiante avant utilisation. Maintenant, étiquetez quatre tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre pour les plasmides et la polyéthylenimine à l’aide d’un marqueur.

Pipeter 500 microlitres d’OptiMinium Essential Medium à chaque tube. Ensuite, ajoutez 10 microgrammes de plasmide au tube plasmidique correspondant et pipettez 30 microlitres de polyéthylenimine dans chaque tube de polyéthylenimine. Mélangez chaque tube délicatement en pipettant de haut en bas et en incubant.

Combinez maintenant chaque tube plasmidique avec son tube correspondant en polyéthylenimine. Mélangez doucement et faites couper le mélange à température ambiante pendant 20 minutes. Aspirez doucement le milieu de culture à partir des plats contenant les cellules 143B.

Ajoutez sept millilitres de substrat sans sérum à chaque plat et étiquetez les plats selon le plasmide à ajouter. Ajoutez le mélange de transfection préparé goutte à goutte dans le plat de culture correspondant. Ajoutez le mélange lentement en cercle depuis le bord extérieur vers le centre du plat.

Incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Jetez le surnageant 8 à 12 heures plus tard. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de DMEM complet à la cuvette de culture et faites l’incubation.

Observez les cellules au microscope à fluorescence 72 heures après avoir remplacé le substrat, retirez le milieu des plats de culture. Ajoutez 1,5 millilitre d’acide trypsina-EDTA pour digérer les cellules. Les cellules pipetent doucement pour détacher les cellules.

Ajoutez ensuite cinq millilitres de milieu complet pour arrêter la digestion. Transférez la suspension de la cellule dans un tube microcentrifuge de 15 millilitres. Ensuite, on pipete 20 microlitres de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre pour compter les cellules.

Prélever 3 fois 10 à la puissance de 5 cellules pour l’extraction de l’acide ribonucléique afin de vérifier l’efficacité du knockdown. Maintenant, semez 2 fois 10 à la puissance de 3 cellules par puits dans une plaque à six puits. Pipette complète le DMEM jusqu’à un volume final de deux millilitres.

Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Surveillez la formation des colonies quotidiennement. Interrompez la culture lorsque la plupart des colonies du groupe témoin contiennent au moins 50 cellules ou après 10 à 14 jours d’incubation.

Après avoir écarté le surnageant, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS par puits, en éliminant la solution après chaque lavage. Fixez les cellules dans un millilitre de solution à 10 % de formol pendant 15 minutes. Jetez le fixateur, puis lavez les cellules deux fois avec un millilitre par puits de PBS.

Colorez les cellules avec un millilitre de solution de violet cristallin à 0,5 % pendant 10 à 30 minutes. Ensuite, lavez doucement l’assiette avec de l’eau du robinet qui coule lentement. Faites sécher les cellules à température ambiante à l’air libre.

Capturez des images des colonies à l’aide d’un appareil photo. L’efficacité de la transfection des cellules 143B a été confirmée par microscopie à fluorescence 72 heures après la transfection, indiquant une livraison efficace des plasmides dans les deux conditions. L’analyse de la réaction RT-qPCR a montré que l’expression de SNHG6 était significativement réduite dans 143 cellules B transfectées avec shSNHG6 par rapport au groupe shNC.

Les tests de formation de colonies ont révélé une réduction significative du nombre et de la taille des colonies dans le groupe knockdown SNHG6 par rapport au groupe témoin. Ce protocole évalue la prolifération à long terme monocellulaire, offrant une pertinence biologique plus élevée et des résultats plus définitifs que les tests de prolifération métabolique à court terme. Des études futures étendront ce protocole à d’autres ARNlnc et modèles tumoraux afin d’explorer systématiquement les mécanismes régulant le potentiel prolifératif des cellules cancéreuses.