Développement de nanovésicules enveloppées de membrane des cellules souches mésenchymateuses pour une meilleure délivrance de gènes

Dans ce protocole, nous introduisons une méthode pour préparer des nanovésicules dérivées des cellules souches mésenchymatières, qui ressemblent à des vésicules extracellulaires et encapsulent des VA pour améliorer la délivrance des gènes. Nous appelons ces nanovésicules contenant des AAV CME-AAV. Comparés au vecteur de délivrance génique émergent EV-AVA, LES CME-AV offrent une plus grande flexibilité dans les sources cellulaires et un rendement plus élevé.

Pour commencer, retirez le milieu de culture d’une cuvette contenant des cellules souches mesenchymateuses humaines à 70 à 90 % de confluence. À l’aide d’un grattoir à cellules, détachez les cellules de la boîte de culture et transférez-les dans un tube conique contenant du PBS. Centrifugez les cellules collectées à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour les pelleter.

Ensuite, lavez la granule cellulaire deux fois avec du PBS et utilisez à nouveau la centrifugeuse. Resuspendez la dernière pellete cellulaire dans le PBS complétée par un cocktail inhibiteur de protéase. Ensuite, soumettez la suspension cellulaire à trois cycles de congélation-dégel pour perturber la membrane plasmique et générer un lysat brut.

À l’aide d’une pipette, homogénéisez soigneusement le lysé. Ensuite, centrifugez à 1 000g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris cellulaires. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.

Centrifugez à 18 000g pendant une heure à quatre degrés Celsius pour pelleter la fraction membranaire. Éliminez le surnageant et resuspendez la granule membranaire dans le PBS pour obtenir la fraction de membrane mésenchymateuse brute. Maintenant, homogénéisez la suspension membranaire en la faisant passer séquentiellement à travers des seringues équipées d’aiguilles de calibre 20 à 27.

Déterminer la concentration en protéines de la suspension membranaire homogénéisée à l’aide d’un test à l’acide bicinchoninique. Alycotez la suspension et stockez à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que ce soit nécessaire. Réhomogénéisez la suspension à l’aide d’une seringue calibre 27 après chaque cycle de décongélation.

Mélangez la suspension membranaire préparée avec un virus adéno-associé, ou AAV, au ratio de 150 microgrammes de protéine par un par 10 pour la puissance de 10 copies du génome. Faites couver le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes en secouant doucement. Chargez la membrane et le mélange viral dans une mini extrudeuse équipée d’une membrane en polycarbonate de 400 nanomètres.

Faites passer le mélange 20 fois dans l’extrudeuse pour favoriser l’encapsulation. Remplacer la membrane de 400 nanomètres par une membrane de 200 nanomètres et répéter l’extrusion. Collectez le virus encapsulé contenant la suspension de procédé, ainsi que le virus non encapsulé et les vésicules vides.

Regroupez plusieurs lots, si nécessaire, et passez immédiatement à la purification. Diluez la solution d’iodixanol avec 10x PBS et de l’eau déionisée stérile pour préparer des solutions à 40 et 25 %. À l’aide d’une pipette, ajoutez un millilitre d’iodixanol à 40 % au fond d’un tube ultra-transparent à paroi fine ouverte de 13,2 millilitres.

Ensuite, superposez trois millilitres d’iodixanol à 25 % au-dessus de la couche à 40 % pour former un gradient discontinu. Superposez doucement sept millilitres de la suspension traitée sur le sommet du gradient. Équilibrez les tubes et chargez-les dans un rotor d’ultracentrifuge à seau pivotant.

Centrifugez à 150 000g pendant trois heures à quatre degrés Celsius, en utilisant une accélération rapide et une décélération lente. Ensuite, retirez soigneusement les tubes sans déranger le dégradé. Collectez des fractions d’un millilitre de haut en bas dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre marqués.

Gardez toutes les fractions sur glace. Identifiez maintenant et regroupez les fractions sept et huit contenant des CME-AAV purifiés dans un nouveau tube ultracentrifuge ouvert à la surface. Complez le volume à 11 millilitres avec PBS.

Ensuite, mélangez doucement avec une pipette d’un millilitre. En utilisant une accélération et une décélération rapides, centrifugez les fractions regroupées à 150 000g pendant trois heures à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant.

Résuspendez la pelote dans 50 à 200 microlitres de PBS stérile, selon la concentration souhaitée. Aliquot, la préparation purifiée. Ensuite, conservez à 80 degrés Celsius jusqu’à une nouvelle utilisation.

Préparer des solutions fonctionnelles pour le virus encapsulé et contrôler le virus dans un PBS stérile. Ajouter des copies égales du génome du virus encapsulé ou du virus témoin directement dans le milieu de culture de chaque puits. Inclure des puits de contrôle négatifs avec un volume équivalent de PBS ou de particules virales vides.

Faites doucement tourner la plaque pour assurer une répartition uniforme et incubez pendant 24 à 72 heures, selon le plan expérimental. Ensuite, aspirez doucement le milieu de culture. Lavez les cellules deux fois avec du PBS sans les déloger.

Colorez les noyaux avec Hoechst 33342 selon les instructions du fabricant. Réalisez l’imagerie à fluorescence des cellules vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée avec des ensembles de filtres appropriés pour renforcer la protéine fluorescente verte et le Hoechst. Sélectionnez des objectifs 10x ou 20x pour la quantification et 63x pour l’imagerie haute résolution, si nécessaire.

Acquérir au moins cinq champs de vision par puits, en utilisant des paramètres d’imagerie identiques. Enregistrez toutes les images en formats raw et en niveaux de gris pour une analyse quantitative. La microscopie électronique en transmission a révélé que les CME-AAV présentaient des dimensions de taille et des structures membranaires similaires à celles des vésicules extracellulaires.

Les marqueurs membranaires mésenchymateux des cellules souches, CD73 et CD90, ont été détectés dans la CME-AAV par analyse Western blot. Les trois principales protéines de la capside virale adéno-associée, VP1, VP2 et VP3, ont été identifiées dans la CME-AAV par SDS-PAGE. L’analyse NanoSight a montré que CME-AAV9.

L’EGFP avait un diamètre moyen de 128,6 nanomètres et une concentration totale de particules de 1,32 fois 10 à la puissance de 10 particules par millilitre. La microscopie à fluorescence a démontré que la CME-AAV9. L’EGFP a produit un niveau nettement plus élevé d’expression accrue des protéines fluorescentes vertes dans HEK293T cellules.

Le virus enveloppé de membrane a atteint une expression génique environ 2,5 fois supérieure, suggérant une meilleure captation cellulaire et un trafic intracellulaire potentiellement amélioré. L’imagerie bioluminescente in vivo a montré que le foie présentait le signal luminescent le plus fort après administration de CME-AAV. L’analyse quantitative des régions hépatiques a révélé que l’administration de CME-AAV a entraîné des niveaux d’expression génique significativement plus élevés.

Ces protocoles décrivent des étapes pour obtenir des AAVA purifiés enveloppés de membrane cellulaire, ou CME-AAV, via l’extrusion et l’ultracentrifugation par gradient de densité. Deux facteurs clés nécessitent une attention particulière : le prétraitement des fragments cellulaires pour l’extrusion et l’optimisation du rapport de mélange fragment membranaire/AAV pour contrôler le rapport particule-AAV par rapport au génome. De futures études pourront approfondir l’enceinte de la membrane cellulaire afin d’améliorer la protection immunitaire et les propriétés fonctionnelles de surface, optimisant ainsi le CME-AAV comme plateforme polyvalente pour la délivrance de l’AAV.