Établissement de cultures primaires enrichies en zone à partir du cortex surrénalen de la souris

Mes recherches ont porté sur la régulation du microenvironnement surrénal, en se concentrant sur la signalisation ACM et Wnt dans la différenciation des zones mégloméruloses et fasciculées, ainsi que sur le développement tumoral. Les méthodes existantes ne peuvent pas distinguer clairement les zones surrénales. Ce protocole enrichit ZG et ZF, permettant l’étude de différents types cellulaires.

Ce protocole peut être appliqué à l’étude de la adrénophysiologie dans ZG et ZF, y compris la zonation et la différenciation cellulaire. Pour isoler la glande surrénale pour une culture primaire enrichie en zone, on utilise de 10 à 15 jeunes souris mâles adultes, âgés d’environ six à sept semaines. Après avoir euthanasié la souris, placez-la en position décubitus dorsale sur une surface plane stérile et désinfectez le pelage animal avec 70 % d’alcool.

À l’aide de ciseaux, réalisez une incision initiale dans la région inguinale de l’abdomen. Étendez l’incision latéralement vers le thorax des deux côtés pour exposer le péritoine. Rétractez la peau avec précaution.

Ensuite, rétractez doucement les muscles abdominaux pour exposer la cavité, évitant ainsi les dommages aux vaisseaux sanguins afin de maintenir une visualisation claire des glandes surrénales. Changez les instruments chirurgicaux pour minimiser la contamination microbienne. Identifier la glande surrénale gauche située médialement et supérieure au rein gauche dans le rétropéritoine, avec une forme ovale et une coloration rose entourée de tissu adipeux blanc.

À l’aide de pinces contondantes, déplacez soigneusement les organes adjacents pour améliorer la visualisation de la glande surrénalienne. À l’aide de ciseaux, retirez la majeure partie du tissu adipeux environnant par des coupures courtes et contrôlées pour isoler la glande surrénalienne. Évitez de saisir directement la glande surrénale pour éviter d’endommager sa capsule.

Placez immédiatement la glande surrénale isolée dans une boîte de culture P60 contenant 10 millilitres de milieu DMEM F-12 préchauffé jusqu’à ce que tous les échantillons soient collectés. Ensuite, identifiez la glande surrénale droite située latéralement et au-dessus du rein droit dans le rétropéritoine, en notant que sa proximité avec le foie, le côlon ascendant et les vaisseaux sanguins voisins peut rendre la visualisation plus difficile. Manipulez soigneusement les veines et artères rénales pour éviter les coupures accidentelles et les saignements.

Après avoir isolé la glande surrénalienne droite, en utilisant la même procédure que pour la glande surrénalienne gauche, placez les deux glandes ensemble dans la même plaque. Nettoyez la cuvette de culture avec 70 % d’alcool avant de transférer les glandes dans la hotte à flux laminaire. Ensuite, lavez les glandes surrénales trois fois en les transférant séquentiellement dans des plats contenant du PBS à 25 degrés Celsius.

Après le lavage final, collectez et entretenez les tissus séparés dans un quatrième plat contenant du DMEM préchauffé afin de préserver la viabilité lors de la préparation de plusieurs glandes. Transférez les glandes surrénales dans un papier filtre pour la dissection. Ensuite, à l’aide de pinces fines, saisir la glande surrénale par le tissu adipeux adhérent.

Disséquez soigneusement la graisse sur le papier filtre avec des mouvements contrôlés pour éviter d’endommager la capsule. Assurez-vous que la glande est lisse et intacte, et exempte d’excès de tissu adipeux et conjonctif. Transférez soigneusement les glandes surrénales sur du papier filtre frais pour faciliter une micro-dissection précise.

À l’aide de pinces fines, pincez doucement la capsule de la glande surrénalienne. À l’aide d’une lame de scalpel, réalisez une incision radiale dans la glande sans complètement transpercer le tissu. Appliquez une légère pression mécanique pour expulser le contenu interne du cortex vers l’extérieur à travers l’incision.

Exposez le matériau glandulaire interne tout en maintenant la capsule et la zone gloméruleuse reliées à la pointe de la pince. Identifiez le matériau glandulaire interne expulsé comme étant la zone fasciculaire et la médule. Initiez la digestion enzymatique seulement après le traitement de toutes les glandes, afin d’assurer une séparation mécanique adéquate des zones externes et internes.

Après centrifugation, re-suspendez les cellules collectées dans un milieu de culture. Après avoir établi la culture cellulaire surrénalienne, effectuer la caractérisation moléculaire des cellules cultivées à l’aide d’une analyse de l’expression génique et de l’immunocoloration. Des cultures cellulaires surrénales primaires ont été établies avec succès à partir de la fraction externe enrichie pour les cellules zonaméglomérulose et de la fraction interne enrichie pour les cellules zona-fasciculées.

Le modèle souris de traçage de lignée a permis la visualisation de l’expression de mGFP spécifique à la zona glomerulosa pilotée par le promoteur Cyp11b2. L’expression de mGFP a été observée principalement dans les cultures enrichies en zonaglomerulosa, tandis que les cultures enrichies en zona fasciculata exprimaient principalement la mTomato. Des niveaux d’expression relatifs plus élevés de Cyp11b2, Dab2 et Sonic hedgehog ont été observés dans les cultures de fractions externes comparées à celles de fractions internes.

Les cultures à fractions internes ont montré une expression relative plus élevée de Cyp11b1 et Akr1b7 comparées aux cultures de fractions externes. La sécrétion d’aldostérone était plus élevée dans les cultures enrichies en zonaglomerulosa que dans les cultures enrichies en zona fasciculata. Dans les cultures de fractions externes, la sécrétion d’aldostérone augmentait encore lors de stimulation avec l’angiotensine II, le potassium et l’hormone adrénocorticotrope.

La sécrétion de corticostérone était plus élevée dans les cultures enrichies en zones fasciculées que dans les cultures enrichies en zona gloméruloses. Les cultures enrichies en zones fasciculates ont montré une sécrétion accrue de corticostérone en réponse à la stimulation de l’hormone adrénocorticotrope et de la forskoline. Ce protocole permet d’étudier la physiologie et la différenciation spécifiques à la zone, y compris la production d’hormones, la voie de signalisation et la matrice extracellulaire.

De futures études pourront explorer les mécanismes de zonation et de différenciation des surrénales, ainsi que l’utilisation de ces cellules pour construire un modèle 3D et étudier les interactions avec la MEC.