L'électroporation cellule unique in vivo dans le cerveau intact développement

Électroporation de cellules individuelles est une technique spécialisée permettant l'incorporation d'ADN ou d'autres macromolécules dans des cellules individuelles au sein d'un tissu intact, y compris dans des préparations in vivo lorsqu'elle est combinée à des techniques avancées d'imagerie in vivo. L'électroporation de marqueurs fluorescents au niveau de la cellule unique permet la visualisation directe de la morphologie cellulaire, de la croissance cellulaire et des événements intercellulaires sur des échelles temporelles allant de quelques secondes à plusieurs jours. Dans cette vidéo, nous détaillons la procédure d'électroporation unitaire d'un colorant fluorescent ou d'ADN plasmidique dans des neurones au sein du cerveau intact de la têtard XUS, et présentons des exemples d'imagerie en direct de neurones marqués de manière fluorescente.

Oh, bonjour. Je m'appelle Eth Haa et je travaille au laboratoire du Dr Kurt Haass au Centre de recherche sur le cerveau de l'Université de la Colombie-Britannique. Aujourd'hui, je vais démontrer comment réaliser une électroporation ciblée au niveau de cellules uniques dans des neurones au sein du cerveau intact de la têtard albino XUS Lavis.

L'avantage distinct de cette technique est qu'elle permet d'effectuer des manipulations expérimentales sur des cellules individuelles tout en laissant le tissu environnant inchangé, permettant ainsi de distinguer les effets cellulaires autonomes de ceux résultant de traitements globaux. La première étape consiste à fabriquer des micropipettes avec un diamètre d'embout et un angle de conicité appropriés, puis à charger le matériel de transfert dans la micropipette. Ensuite, les pools de TA doivent être anesthésiés et transférés dans la chambre d'enregistrement, suivis par l'insertion de la micropipette dans le cerveau et l'application d'une série d'impulsions de tension.

Enfin, les neurones transférés sont observés à l'aide de la microscopie à deux photons. Cette technique vous sera montrée chez les têtards. L'activation de cellules uniques peut également être utilisée dans d'autres systèmes modèles ainsi que dans des préparations ex vivo.

Ainsi, gardons cela à l'esprit et commençons. L'électroporation de cellule unique cible une cellule individuelle à l'aide d'une microélectrode en verre étirée qui limite le champ électrique à une seule cellule en contact avec l'extrémité de la pipette. La géométrie physique de l'extrémité de la pipette est une caractéristique essentielle qui influence directement le succès de la technique.

Un tireur de micropipettes modèle P 97 à soudeur est utilisé pour fabriquer des micropipettes à partir de verre borosilicaté ayant un diamètre externe de 1,5 millimètre et un diamètre interne de 0,75 millimètre, contenant un filament interne afin de faciliter le remplissage de l'extrémité sans bulles d'air. Les extrémités de pipettes qui se sont révélées les plus efficaces pour l'électroporation de cellules uniques sont celles dont le diamètre varie de 0,5 à un micron et dont les angles de conicité dépassent 10 degrés. Après l'étirage d'une micropipette en verre, le matériau en solution peut être chargé dans la pipette par remplissage arrière ou à l'aide d'une seringue de chargement.

Pour cette démonstration, nous allons marquer de manière fluorescente des neurones uniques à l’aide d’un colorant fluorescent, visible ici, ou d’un plasmide codant. Les solutions de protéine verte fluorescente (GFP) doivent être brièvement centrifugées à grande vitesse afin de réduire la quantité de débris particulés qui pénètrent dans la pipette. Étant donné que cela augmente les risques d’obstruction de l’embout pour les nouveaux utilisateurs, il est conseillé de commencer avec des colorants fluorescents, car ceux-ci sont facilement visibles en fluorescence épiscopique.

Ceci permet la visualisation de l'embout à l'intérieur de l'échantillon et fournit un retour direct sur le bon réglage du matériel et sur l'adéquation de l'embout de pipette. Bien joué. Maintenant que nous avons préparé la micropipette, nous pouvons passer à la réalisation de la procédure d'électroporation unitaire de cellule.

Le matériel électrique nécessaire pour cette technique comprend un stimulateur, un oscilloscope et un porte-pipette équipé d'un fil d'argent à insérer dans la pipette. Ici, nous utilisons un Axon Instruments Axon Separator 800 A, mais des stimulateurs courants tels que le Grass SD9 peuvent également être utilisés. L'Axon Separator est relié à l'étage d'amplification, qui fait interface entre l'Axon Separator et l'électrode en fil d'argent.

Le sol extérieur de la têtard est simplement un fil d'argent qui maintient un contact électronique avec le têtard. Pendant l'électroporation, l'étage de tête, le câble de masse et le sol extérieur du têtard sont tous deux connectés à l'entrée de l'oscilloscope. Une fois que le matériel électrique a été mis en place, la pipette peut être placée dans le porte-pipette.

Le support de pipette doit être monté sur un micromanipulateur à trois axes permettant des déplacements précis. L'électroporation de cellule unique nécessite un microscope offrant une distance de travail suffisante. Cela laisse plus d'espace pour manœuvrer et permet d'insérer la pipette selon un angle d'environ 30 à 45 degrés.

Une fois l'équipement correctement connecté, nous pouvons commencer une procédure d'électroporation unitaire. Les têtards sont d'abord anesthésiés par immersion dans du MS 0,02 %, 2,2,2 ; les têtards sont généralement complètement anesthésiés. Après environ cinq minutes, un têtard unique est transféré dans la chambre d'électroporation.

À l’aide d’une pipette plastique de transfert, la chambre peut être facilement fabriquée en laboratoire en creusant une cavité en forme de têtard dans un petit bloc de silicone et en insérant un fil de masse en argent de manière à ce qu’il soit en contact avec la peau du têtard lorsqu’il est placé dans la chambre. Ensuite, l’utilisation d’un pinceau pour positionner le têtard permettra de s’assurer qu’il est placé en position dorsale supérieure. La micropipette est alors abaissée jusqu’à ce qu’elle entre en contact avec la peau directement adjacente à la région d’intérêt.

La poursuite de la descente de la pipette provoque initialement un affaissement de la peau, puis pénètre dans le tissu sous-jacent. Ici, je vise le tubercule optique du cerveau du tide pole. Je cherche spécifiquement la région de la couche des corps cellulaires.

Si vous utilisez un xi, on peut surveiller la résistance de la pipette dans le tissu. Généralement, la résistance est comprise entre 10 et environ 40. Des mégohms conviennent bien.

La résistance de la pipette est un bon indicateur permettant de déterminer si le diamètre de l'embout est trop petit ou si l'embout est bouché, auquel cas la résistance sera élevée. En revanche, si le diamètre de l'embout est trop grand ou si l'embout est cassé, la résistance de la pipette sera faible. Bien que la résistance absolue, la pipette ne puisse pas être mesurée lorsqu'on utilise un stimulateur conventionnel.

La lecture de l'oscilloscope constitue une mesure indirecte de la résistance de la pipette pour les colorants au dextran fluorescent. Le stimulus consiste en une série de 10 millisecondes d'impulsions carrées positives appliquées à une fréquence de 300 hertz. Chaque impulsion dure 300 microsecondes et est délivrée à une tension de 50 volts.

Grâce à ces paramètres, le colorant fluorescent est expulsé de l'extrémité, comme on peut l'observer lors de l'application d'un stimulus après électrosondage. À un emplacement donné, la pipette est retirée et le processus est répété à différents sites au sein du tissu afin d'améliorer le rendement. Pendant la délivrance d'une série d'impulsions de tension, on doit surveiller l'amplitude des impulsions résultantes sur l'oscilloscope et ajuster cette amplitude entre 1 et 1,5 microampères si nécessaire.

Si l'amplitude de l'impulsion reste faible après une augmentation importante de la tension ou diminue au cours de la procédure, cela suggère fortement que la pointe est obstruée ou que son diamètre est trop petit. Cela peut être assez frustrant lorsque cela se produit. En revanche, si l'amplitude reste élevée après une réduction importante de la tension appliquée ou augmente au cours de la procédure, cela indique fortement que la pointe est soit trop large, soit cassée, ou que les pointes se brisent.

Je deviens souvent très émotif et triste. Comme mentionné précédemment, l'avantage de l'utilisation de colorants fluorescents est qu'on peut vérifier immédiatement si des cellules uniques ont été électroporées à l'aide des paramètres de stimulation donnés. Si les cellules apparaissent très faibles ou si aucune cellule n'est marquée, on commencerait par augmenter progressivement chaque paramètre de stimulation indépendamment jusqu'à ce que les cellules marquées apparaissent brillamment marquées comme ceci ; voir des cellules bien marquées illumine ma journée.

D’un autre côté, si de nombreuses cellules semblaient marquées, on diminuerait progressivement les paramètres du stimulus jusqu’à ce qu’il semble qu’une seule cellule soit fortement marquée comme celle-ci. Observer des cellules fortement marquées est vraiment satisfaisant. Dans le cas de l’ADN plasmidique, les trains d’impulsions utilisés sont des impulsions négatives d’une durée d’un milliseconde délivrées à 300 hertz, et la durée du train est de 500 millisecondes.

Après électroporation, les têtards sont placés dans une solution d'élevage fraîche où ils se remettent rapidement de l'anesthésie. Habituellement, après électroporation de 50 à 100 têtards, nous pouvons passer à leur sélection, ce que je vais vous montrer ensuite. Avant de commencer les expériences d'imagerie, il est utile de trier rapidement les têtards électroporés à l'aide d'un microscope à épifluorescence droit.

Afin de déterminer quels têtards possèdent des neurones adaptés à l'imagerie, les têtards sont anesthésiés, puis placés dans une chambre en forme de cigare et recouverts d'une lame couvre-objet. Les cerveaux individuels de têtards sont ensuite observés rapidement en lumière épi-fluorescente pour vérifier la présence de neurones marqués de manière fluorescente. Remarque : une exposition excessive à la lumière épi-fluorescente entraîne une phototoxicité pouvant provoquer la mort de la cellule marquée. Par conséquent, veillez à minimiser le temps d'exposition des cellules à la lumière fluorescente.

Dans le cas des colorants au dextran, l'analyse peut être effectuée dès 30 minutes après l'électroporation. Toutefois, nous constatons que des intervalles plus longs sont associés à des niveaux de fluorescence de fond plus faibles. Dans le cas du plasmide, le criblage de l'ADN est généralement réalisé au moins 12 heures après l'électroporation.

Nous utilisons couramment l'électroporation de cellules uniques pour marquer de manière fluorescente les neurones au sein du tectum optique de la larve de grenouille. Notre microscope à deux photons est conçu sur mesure, construit à partir d'un microscope confocal Olympus FV 300 et d'une source lumineuse laser Chameleon XP. Nous utilisons généralement une longueur d'onde de 910 nanomètres pour visualiser la fluorescence verte.

Une fois qu’un têtard présentant un seul neurone AL marqué a été identifié et positionné sur notre dispositif d’imagerie à deux photons, nous procédons à une acquisition d’images en laps de temps de neurones tactiles à différents intervalles. Cela nous permet d’observer les schémas dynamiques de croissance des arborisations dendritiques des cellules AL. Ici, nous voyons un exemple d’un neurone exprimant la GFP qui a été marqué par électroporation au niveau d’une cellule unique.

Cette image a été capturée à l'aide de la microscopie à deux photons in vivo afin de quantifier la croissance neuronale. Des reconstructions tridimensionnelles en squelette de chaque image neuronale sont généralement générées. L'imagerie en accéléré avec des intervalles prolongés permet de comprendre les conséquences à long terme d'une manipulation expérimentale.

Ici, nous observons un neurone immature exprimant la GFP qui a été imagé quotidiennement pendant quatre jours, couvrant ainsi l'élaboration de son arborisation dendritique. Ces images ont été capturées par microscopie à deux photons et sont présentées sous forme de projections en Z. L'imagerie en laps de temps rapide nous permet d'observer la nature de processus plus dynamiques de la croissance neuronale, notamment la formation et le retrait des filopodes dendritiques.

Ce vidéo montre un neurone exprimant la GFP relativement mature qui a été imagé en trois dimensions toutes les deux minutes pendant une heure. Il s'agit d'un exemple de neurone immature exprimant la GFP qui a été imagé toutes les cinq minutes au cours d'une heure. Les neurones plus jeunes sont très dynamiques, montrant une importante croissance des branches ainsi que des rétractions de branches.

Une vue agrandie de ce neurone exprimant la GFP montre l'ajout et le retrait constants de filopodes dendritiques, un phénomène typique des neurones en développement dans ce système. La transparence du têtard albinos et l'accessibilité de son cerveau rendent ce modèle particulièrement adapté à la visualisation de la croissance neuronale et des événements intracellulaires au sein d'un organisme vivant. L'électroporation au niveau d'une cellule unique nous permet d'observer la croissance d'un seul neurone et de réaliser des manipulations autonomes au niveau cellulaire dans un cerveau globalement inchangé.

Nous venons donc de vous montrer comment réaliser une électroporation unicellulaire dans les pôles zap lavis tat, bien que nous nous concentrions ici sur l'électroporation dans les pôles TA. Cette technique a été utilisée chez d'autres organismes et également appliquée à des tranches d'hippocampe et à des cultures cellulaires dissociées. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de veiller à modifier constamment les embouts de vos pipettes et les paramètres de stimulation afin de maintenir un rendement élevé.

Voilà tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.