Un protocole optimisé pour l’infection à Candida albicans chez Schmidtea mediterranea afin d’étudier la pathogenèse fongique et la défense de l’hôte

Mes recherches portent sur les infections à Candida albicans et sur la manière dont les réponses de l’hôte influencent l’élimination ou la progression de la maladie. Un défi majeur est l’absence de modèles pour les infections fongiques précoces. Ce protocole utilise le planaire comme solution facile à gérer et à haut débit.

Le système planaire permet d’étudier l’initiation, la progression, la dégradation et la létalité de la maladie, grâce à une mesure à haute résolution des réponses immunitaires innées. Pour commencer, sélectionnez des planaires Schmidtea mediterranea d’environ cinq millimètres de long au stéréomicroscope, et assurez-vous que les animaux sont complètement étendus avant de mesurer. Évitez d’utiliser des planaires de moins de cinq millimètres, car elles peuvent inclure des personnes présentant des blastèmes ou un développement incomplet pouvant produire des résultats incohérents.

De plus, excluez les planaires de plus de cinq millimètres, car les animaux plus grands sont moins adaptés à l’immunocoloration par fluorescence. Excluez les animaux présentant des blastemas, des tissus dépourvus de pigmentation ou un développement incomplet de la pigmentation. Transférer des planaires sains répondant à tous les critères d’inclusion dans deux millilitres d’eau planaire fraîche par puits dans une plaque de polystyrène à six puits non traitée en culture tissulaire.

Attribuer des puits pour des contrôles négatifs composés d’animaux non infectés ou traités simulés et des contrôles positifs pour des animaux infectés par Candida albicans de type sauvage. Retirez toute l’eau de chaque puits et remplacez-la par deux millilitres d’eau planaire douce pour assurer l’uniformité entre les puits. Laissez les animaux s’équilibrer dans le nouvel environnement pendant une journée avant l’infection.

Inclinez la plaque à six puits et retirez doucement toute l’eau d’un puits à la fois, en utilisant la technique aseptique. Ajoutez immédiatement le volume calculé d’eau planaire et de culture de Candida albicans au puits avant de passer au puits suivant. Notez la date et l’heure de l’inoculation.

Placez la plaque à six puits inoculée dans un endroit sombre et statique à température ambiante. Incubez la planaire avec Candida albicans pendant jusqu’à 72 heures, selon le point final souhaité. Au premier moment, 24 heures après l’infection, inclinez légèrement la plaque.

Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert stérile, aspirez le liquide contenant la culture de Candida albicans et délicatez-le dans une zone du puits exempte d’animaux pour mélanger la couche fongique déposée. Répétez cette étape cinq à dix fois par puits pour briser la couche fongique déposée, évitant ainsi le contact direct avec les planaires. Observez le dépôt fongique sur un fond sombre avant et après les étapes de resuspension, pour une meilleure visibilité.

Resuspendez les puits de contrôle non infectés dans des conditions identiques. Répétez cette procédure 48 heures après l’infection. À 72 heures après l’infection, transférez les planaires dans des puits frais avec deux millilitres d’eau propre, minimisant ainsi la transmission fongique en utilisant un minimum de liquide.

Une fois les animaux transférés, retirez toute l’eau et remplacez-la par de l’eau planaire fraîche. Commencez à évaluer les résultats de l’hôte un jour après l’infection et continuez quotidiennement jusqu’à l’objectif expérimental souhaité. Quantifiez les dommages causés à l’hôte en utilisant le système standardisé de notation zéro à trois.

Trois jours après l’infection, transférez doucement la planaire sur une nouvelle plaque à six puits contenant deux millilitres d’eau planaire fraîche par puits, tout en évitant le transfert de la culture fongique résiduelle. Observer les animaux à l’aide de la microscopie optique avec un objectif minimum 10 fois supérieur. Notez les résultats de l’hôte à l’aide de la feuille de notation standardisée.

De plus, une immunocoloration anti-Candida peut être réalisée pour observer la colonisation fongique de l’épithélium de l’hôte lors de l’infection et de l’élimination. La colonisation épithéliale fongique a été nettement réduite quatre jours après l’infection, et sept jours après l’infection, presque tous les champignons associés à la surface ont été éliminés dans les conditions ID50. Les témoins non infectés sont restés totalement asymptomatiques.

À environ 7,0 fois 10 à la puissance de sept cellules de Candida albicans par millilitre, environ 30 % étaient asymptomatiques, 50 % symptomatiques et 20 % étaient décédés. À environ 8,0 fois 10 à la puissance de sept cellules de Candida albicans par millilitre, environ 30 % étaient asymptomatiques, 20 % symptomatiques et 50 % étaient décédés. La survie médiane est passée d’environ 90 % à 7,0 fois 10 à la puissance de sept cellules de Candida albicans par millilitre à environ 50 % à 8,0 fois 10 à la puissance de sept cellules par millilitre, et à moins de 25 % à 8,5 fois 10 à la puissance de sept cellules par millilitre.

La survie globale était d’environ 50 % chez les planaires infectées par Candida albicans de type sauvage, soit environ 8,0 fois 10 à la puissance de sept cellules par millilitre, contre 100 % de survie chez les témoins non infectés. Ce protocole permet une étude in vivo de la dynamique hôte-pathogène en intégrant des approches d’imagerie et moléculaires dans un hôte génétiquement manipulable. Les applications futures incluent le dépistage à haut débit des mutants, des études comparatives entre espèces microbiennes, ainsi que l’adaptation pour la toxicologie et les tests d’efficacité des médicaments.