Une méthode HPLC-QQQ-MS efficace et rapide pour la quantification des alcaloïdes tropanes dans les plantes médicinales

Nous avons développé une méthode HPLC-QQQ-MS pour quantifier rapidement trois alcaloïdes tropanes majeurs chez Anisodus tanguticus. Le HPLC conventionnel manque de sensibilité aux alcaloïdes tropane. Cette méthode utilise la spectrométrie de masse très sensible pour résoudre ce problème.

Pour commencer, pesez avec précision 10,0 milligrammes d’hyoscyamine, d’hydrobromure d’anisodamine et de bromure d’hydrobromure de scopolamine. Placez-les dans une fiole volumétrique séparée de 10 millilitres. Ajoutez du méthanol de qualité chromatographique à la ligne marquée dans chaque flasque volumique.

Dissoudre soigneusement les standards avec un traitement ultrasonique pour préparer des solutions standard uniques avec une concentration de 1,0 milligramme par millilitre. Ensuite, transférez les solutions d’origine dans des flacons de réactifs bruns et conservez-les à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Pour préparer une solution intermédiaire standard mixte de 10 microgrammes par millilitre, pipettez 100 microlitres de chaque solution de stock préalablement préparée dans une fiole volumétrique de 10 millilitres.

Ensuite, ajoutez du méthanol de qualité chromatographique à la ligne marquée pour diluer la solution. Ensuite, effectuez la lyophilisation du matériau frais de Sophora flavescens. Ensuite, à l’aide d’un moulin à grande vitesse, pulvérissez le matériau séché en une poudre homogène.

Passez la poudre à travers un tamis standard de 0,25 millimètre. Pèser précisément 20 milligrammes de poudre tamisée. Transférez-le dans une fiole volumétrique de 100 millilitres et ajoutez du méthanol de qualité chromatographique juste en dessous de la ligne marquée.

Ensuite, effectuez une extraction ultrasonique à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez la fiole volumétrique et laissez-la refroidir à 25 degrés Celsius à température ambiante. Ajoutez du méthanol de qualité chromatographique à la ligne marquée de 100 millilitres et le vortex pour mélanger pendant deux minutes.

Ensuite, pipettez un millilitre de l’extrait préparé dans une fiole volumétrique de 100 millilitres. Ajoutez du méthanol à la ligne marquée. Secouez soigneusement pour bien mélanger et obtenez la solution mère pour l’injection de HPLC.

Pour la filtration de l’échantillon, préparez une seringue jetable sans aiguille d’un millilitre et une membrane microporeuse en phase organique de 0,22 micromètre. Aspirez 1,2 millilitre de la solution mère pour injection dans la seringue et filtrez la solution en la poussant lentement à travers la membrane. Prélever le filtrat dans un flacon d’échantillon de deux millilitres avec un insert intérieur et sceller le flacon hermétiquement avec un bouchon.

Préparez la phase mobile A en mesurant 1000 millilitres d’eau ultrapure. Ajoutez 1,0 millilitre d’acide formique de qualité chromatographique et mélangez uniformément à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 10 minutes. Ensuite, préparez la phase B mobile en utilisant directement le méthanol de qualité chromatographique sans traitement supplémentaire.

Dégaze les phases mobiles A et B à 40 kilohertz pendant 15 minutes à l’aide d’unités de dégazage ultrasonique distinctes. Reliez les phases mobiles dégazées dans des bouteilles de solvant séparées aux lignes A et B correspondantes du système HPLC. Utilisez une colonne C18 pour la séparation chromatographique.

Équilibrez la colonne avec du méthanol et de l’eau dans un ratio de 80 à 20 pendant 30 minutes à un débit de 0,3 millilitres par minute. Réglez la température du four en colonne à 30 degrés Celsius et préchauffez 10 minutes à l’avance. Ensuite, réglez le débit à 0,60 millilitres par minute, le volume d’injection à deux microlitres et la longueur d’onde de détection à 210 nanomètres.

Ensuite, définissez le programme d’élution du gradient avec les conditions présentées. Effectuer la détection par spectrométrie de masse à l’aide d’un spectromètre de masse quadrupôle triple équipé d’une source d’ionisation électropulvérisatrice fonctionnant en mode ionisation positive. Réglez la pression du nébuliseur à 15 livres par pouce carré, la tension capillaire à 4 000 volts, la température du gaz à 300 degrés Celsius et le débit de gaz à 11 litres par minute.

Ensuite, définissez les paramètres pour plusieurs paires d’ions de surveillance de réaction. Pour identifier les ions précurseurs, infusez directement des solutions standard individuelles en mode balayage MS2. Après validation de la méthode, effectuer l’acquisition de données en mode de surveillance de réactions multiples.

Utilisez les paramètres optimisés, incluant l’ion précurseur, les transitions ions produit, la tension du fragmentateur et l’énergie de collision pour chaque analyte présentés ici. Lancez le logiciel d’analyse qualitative. Sélectionnez fichier et choisissez importer les données pour importer tous les fichiers collectés.

Vérifiez la symétrie de pic et la constance du temps de rétention des pics cibles dans chaque chromatogramme ionique extrait. Dans le module de quantification, sélectionnez la transition MRM. Entrez les paires d’ions précurseurs et d’ions produit pour chaque composant et extrayez les chromatogrammes ioniques extraits correspondants.

Calculez la surface maximale pour l’analyse quantitative. Les trois alcaloïdes tropanes ciblés ont été séparés avec succès en moins de 20 minutes dans les conditions HPLC optimisées. La résolution entre scopolamine et anisodamine était de 8,67.

Alors que celle entre l’anisodamine et l’hyoscyamine a atteint 11,58, toutes les valeurs de résolution ont nettement dépassé le critère de séparation de base de 1,5. Tous les analytes ont montré une bonne linéarité sur une plage de concentration de 0,014 à 0,320 microgramme par millilitre avec des coefficients de corrélation supérieurs à 0,99. Les guérisons moyennes étaient de 101,44 % pour la scopolamine, 100,25 % pour l’anisodamine et 99,56 % pour l’hyoscyamine, avec des écarts-types relatifs de 1,85 %, 2,35 % et 1,9 % respectivement.

La quantification de trois alcaloïdes tropanes dans 10 échantillons d’Anisodus tanguticus a montré que la teneur en scopolamine variait de 0,3667 milligramme par gramme dans l’échantillon six à 1,0356 milligramme par gramme dans l’échantillon sept. La teneur en anisodamine variait de 0,0269 milligramme par gramme dans l’échantillon six à 0,3590 milligramme par gramme dans l’échantillon 10. La teneur en hyoscyamine variait de 0,2930 milligramme par gramme dans l’échantillon deux à 1,4989 milligramme par gramme dans l’échantillon 10, avec des niveaux plus élevés observés dans les échantillons quatre, sept, neuf et dix.

Ce protocole permet une quantification rapide et précise de trois alcaloïdes tropanes majeurs. Le principal défi est d’assurer la procédure des instruments et la préparation standardisée de l’échantillon pour des mesures précises. Cette méthode peut être étendue pour explorer et quantifier d’autres métabolites chez Anisodus tanguticus.