ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par la Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011278), le projet autofinancé de l'Institut de recherche en biotechnologie de la province du Guangdong (GDBRI-ZL202602) et l'échange et la coopération académiques Chine-Canada sur les modèles et la pathogenèse des maladies cardiovasculaires (MS202500058).

<ol>
	<li>Fauconnier, J., Meli, A. C., Thireau, J., Roberge, S., Shan, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+receptor+leak+mediated+by+caspase-8+activation+leads+to+left+ventricular+injury+after+myocardial+ischemia-reperfusion.">Ryanodine receptor leak mediated by caspase-8 activation leads to left ventricular injury after myocardial ischemia-reperfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13258-13263 (2011).</li><li>Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+remodeling-concepts+and+clinical+implications:+a+consensus+paper+from+an+international+forum+on+cardiac+remodeling.">Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.</a> J Am Coll Cardiol. , (2000).</li><li>Liu, D., Tian, X., Liu, Y., Song, H., Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREG+ameliorates+the+phenotypic+switching+of+cardiac+fibroblasts+after+myocardial+infarction+via+modulation+of+CDC42.">CREG ameliorates the phenotypic switching of cardiac fibroblasts after myocardial infarction via modulation of CDC42.</a> Cell Death Dis. 12 (4), (2021).</li><li>Contessotto, P., Pandit, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapies+to+prevent+post-infarction+remodelling:+from+repair+to+regeneration.">Therapies to prevent post-infarction remodelling: from repair to regeneration.</a> Biomaterials. 275, (2021).</li><li>Zhu, R., Sun, H., Yu, K., Zhong, Y., Shi, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-37+and+dendritic+cells+treated+with+interleukin-37+plus+troponin+I+ameliorate+cardiac+remodeling+after+myocardial+infarction.">Interleukin-37 and dendritic cells treated with interleukin-37 plus troponin I ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction.</a> J Am Heart Assoc. 5 (12), (2016).</li><li>Chang, Y., Zhang, J., Huo, X., Qu, X., Xia, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+rigidity+dictates+colorectal+tumorigenic+cell+stemness+and+metastasis+via+CRAD-dependent+mechanotransduction.">Substrate rigidity dictates colorectal tumorigenic cell stemness and metastasis via CRAD-dependent mechanotransduction.</a> Cell Rep. 38 (7), (2022).</li><li>Seo, Y., Jang, J., Ko, K. P., Zou, G., Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dysregulation+induces+immune+evasion+via+oxidative+stress-activated+PD-L1+in+gastric+cancer.">Actin dysregulation induces immune evasion via oxidative stress-activated PD-L1 in gastric cancer.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Kim, B., Zhang, S., Huang, Y., Ko, K. P., Jung, Y. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRACD+loss+induces+neuroendocrine+cell+plasticity+of+lung+adenocarcinoma.">CRACD loss induces neuroendocrine cell plasticity of lung adenocarcinoma.</a> Cell Rep. 43 (6), (2024).</li><li>Jung, Y. S., Wang, W., Jun, S., Zhang, J., Srivastava, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+CRAD-controlled+cytoskeleton+initiates+mucinous+colorectal+cancer+via+&#946;-catenin.">Deregulation of CRAD-controlled cytoskeleton initiates mucinous colorectal cancer via &#946;-catenin.</a> Nat Cell Biol. 20 (11), 1303-1314 (2018).</li><li>Liu, Z., Cao, H., Shi, Y., Yang, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIAA1211+plays+an+oncogenic+role+in+human+non-small+cell+lung+cancer.">KIAA1211 plays an oncogenic role in human non-small cell lung cancer.</a> J Cancer. 10 (26), 6747-6753 (2019).</li><li>Snider, P. L., Snider, E., Simmons, O., Lilly, B., Conway, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uncharacterized+mKiaa1211+expression+during+mouse+development+and+cardiovascular+morphogenesis.">Analysis of uncharacterized mKiaa1211 expression during mouse development and cardiovascular morphogenesis.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 6 (2), (2019).</li><li>Lin, Y. H., Warren, C. M., Li, J., McKinsey, T. A., Russell, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibril+growth+during+cardiac+hypertrophy+is+regulated+through+dual+phosphorylation+and+acetylation+of+the+actin+capping+protein+CapZ.">Myofibril growth during cardiac hypertrophy is regulated through dual phosphorylation and acetylation of the actin capping protein CapZ.</a> Cell Signal. 28 (8), 1015-1024 (2016).</li><li>Yang, F. H., Pyle, W. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cardiac+CapZ+protein+protects+hearts+against+acute+ischemia-reperfusion+injury+and+enhances+preconditioning.">Reduced cardiac CapZ protein protects hearts against acute ischemia-reperfusion injury and enhances preconditioning.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (3), 761-772 (2012).</li><li>Tong, C., Huang, G., Ashton, C., Wu, H., Yan, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+cost-effective+gene+targeting+in+rat+embryonic+stem+cells+by+TALENs.">Rapid and cost-effective gene targeting in rat embryonic stem cells by TALENs.</a> J Genet Genomics. 39 (6), 275-280 (2012).</li><li>Cordes, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-ethyl-N-nitrosourea+mutagenesis:+boarding+the+mouse+mutant+express.">N-ethyl-N-nitrosourea mutagenesis: boarding the mouse mutant express.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69 (3), 426-439 (2005).</li><li>Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Kanke, K. L., Rayner, R. E., Bozik, J., Abel, E., Venugopalan, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+with+internal+base+modifications+mediates+highly+efficient+knock-in+in+primary+cells+using+CRISPR-Cas9.">Single-stranded DNA with internal base modifications mediates highly efficient knock-in in primary cells using CRISPR-Cas9.</a> Nucleic Acids Res. 52 (22), 13561-13576 (2024).</li><li>Mihos, C. G., Liu, J. E., Anderson, K. M., Pernetz, M. A., O'Driscoll, J. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speckle-tracking+strain+echocardiography+for+the+assessment+of+left+ventricular+structure+and+function:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Speckle-tracking strain echocardiography for the assessment of left ventricular structure and function: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 152 (10), (2025).</li><li>Garg, P. K., Biggs, M. L., Kizer, J. R., Shah, S. J., Psaty, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+dysregulation+and+subclinical+cardiac+dysfunction+in+older+adults:+the+Cardiovascular+Health+Study.">Glucose dysregulation and subclinical cardiac dysfunction in older adults: the Cardiovascular Health Study.</a> Cardiovasc Diabetol. 21 (1), (2022).</li><li>Asanuma, T., Fukuta, Y., Masuda, K., Hioki, A., Iwasaki, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+myocardial+ischemic+memory+using+speckle+tracking+echocardiography.">Assessment of myocardial ischemic memory using speckle tracking echocardiography.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 5 (1), 1-11 (2012).</li><li>Chong, S. Y., Zharkova, O., Yatim, S. M. J. M., Wang, X., Lim, X. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+cytoplasmic+domain+exacerbates+post-infarct+left+ventricular+remodeling+via+orchestrating+cardiac+inflammation+and+angiogenesis.">Tissue factor cytoplasmic domain exacerbates post-infarct left ventricular remodeling via orchestrating cardiac inflammation and angiogenesis.</a> Theranostics. 11 (19), 9243-9261 (2021).</li><li>Hung, C. L., Verma, A., Uno, H., Shin, S. H., Bourgoun, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+and+circumferential+strain+rate,+left+ventricular+remodeling,+and+prognosis+after+myocardial+infarction.">Longitudinal and circumferential strain rate, left ventricular remodeling, and prognosis after myocardial infarction.</a> J Am Coll Cardiol. 56 (22), 1812-1822 (2010).</li><li>Labuhn, M., Adams, F. F., Ng, M., Knoess, S., Schambach, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+sgRNA+efficacy+prediction+improves+large-+and+small-scale+CRISPR-Cas9+applications.">Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications.</a> Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).</li><li>Wu, J., Bu, L., Gong, H., Jiang, G., Li, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+heart+rate+and+anesthetic+timing+on+high-resolution+echocardiographic+assessment+under+isoflurane+anesthesia+in+mice.">Effects of heart rate and anesthetic timing on high-resolution echocardiographic assessment under isoflurane anesthesia in mice.</a> J Ultrasound Med. 29 (12), (2010).</li><li>Voigt, J. U., Pedrizzetti, G., Lysyansky, P., Marwick, T. H., Houle, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+for+a+common+standard+for+2D+speckle+tracking+echocardiography:+consensus+document+of+the+EACVI/ASE/Industry+Task+Force+to+standardize+deformation+imaging.">Definitions for a common standard for 2D speckle tracking echocardiography: consensus document of the EACVI/ASE/Industry Task Force to standardize deformation imaging.</a> J Am Soc Echocardiogr. 28 (2), 183-193 (2015).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), (2014).</li><li>Gao, E., Lei, Y. H., Shang, X., Huang, Z. M., Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>R&#246;sner, A., Barbosa, D., Aars&#230;ther, E., Kj&#248;n&#229;s, D., Schirmer, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+frame+rate+on+two-dimensional+speckle-tracking+strain+measurements:+a+study+on+silico-simulated+models+and+images+recorded+in+patients.">The influence of frame rate on two-dimensional speckle-tracking strain measurements: a study on silico-simulated models and images recorded in patients.</a> Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16 (10), 1137-1147 (2015).</li><li>Argiro, A., Bui, Q., Hong, K. N., Ammirati, E., Olivotto, I., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+gene+therapy+in+cardiomyopathies.">Applications of gene therapy in cardiomyopathies.</a> JACC Heart Fail. 12 (2), 248-260 (2024).</li><li>Micheletti, R., Plaisance, I., Abraham, B. J., Sarre, A., Ting, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+noncoding+RNA+Wisper+controls+cardiac+fibrosis+and+remodeling.">The long noncoding RNA Wisper controls cardiac fibrosis and remodeling.</a> Sci Transl Med. 9 (395), (2017).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Juliano, R. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delivery+of+therapeutic+oligonucleotides.">The delivery of therapeutic oligonucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 44 (14), 6518-6548 (2016).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt concurrentiel.

Dans cette étude, nous avons généré une souris déficiente pour Cracd à l'aide de CRISPR/Cas9 et mis en place un protocole pour la phénotyper après un infarctus du myocarde (IM) en utilisant l'échocardiographie conventionnelle, l'imagerie par corrélation de taches (speckle-tracking strain imaging) et l'histologie. Le protocole a permis d'obtenir des souris knock-out avec une perte confirmée de la protéine CRACD. Les souris déficientes pour Cracd présentaient une dilatation ventriculaire moindre, une meilleure fraction d'éjection (EF) et une fibrose réduite par rapport aux témoins de type sauvage (WT) après l'IM, confirmant ainsi l'utilité du modèle pour l'étude du remodelage cardiaque.
La réussite de ce modèle dépend de plusieurs étapes critiques. La conception du gRNA et sa validation in vitro influencent directement l'efficacité de l'édition des zygotes23. Nous utilisons CRISPick ou Benchling pour sélectionner des gRNAs ayant des scores CRISPRater ≥ 0,5, puis nous testons l'efficacité de clivage à l'aide d'un essai Cas9/gRNA in vitro. Seuls les gRNAs présentant un clivage > 50 % sont microinjectés. La ligature adéquate de l'artère interventriculaire antérieure (LAD) est tout aussi cruciale : la suture 7‑0 doit passer à 2–3 mm de l'origine de la LAD, à une profondeur de 0,5–1 mm, afin d'éviter de percer le ventricule droit (trop profond) ou de ne pas occlure le vaisseau (trop superficiel) ; le blanchissement immédiat de la paroi antérieure confirme l'occlusion. Le contrôle de la fréquence cardiaque pendant l'échocardiographie est également essentiel24 ; maintenir une fréquence de 450–550 bpm en ajustant l'isoflurane (généralement 1–2 %) améliore la reproductibilité des mesures conventionnelles et des mesures de déformation. Enfin, pour l'analyse par suivi de taches (speckle-tracking), l'évaluation visuelle du maillage codé en couleurs est indispensable25. Le maillage doit suivre les contours du myocarde sans à-coups ; sinon, un affinage manuel est nécessaire ; si la qualité reste médiocre après trois tentatives, la souris est exclue.
Même lorsque le protocole est suivi méticuleusement, certaines difficultés techniques peuvent survenir. Un dépannage systématique permet de résoudre la plupart d'entre elles. De faibles taux de transmission germinale (inférieurs à 10 %) indiquent généralement une mauvaise intégration de l'oligonucléotide donneur ou une activité faible de la gRNA26. Par conséquent, augmenter la concentration de l'oligo donneur à 20 ng/µL, allonger les bras d'homologie à 120–200 pb et vérifier à nouveau l'efficacité de coupure de la gRNA (&#62; 50 %) peut améliorer la transmission. Une mortalité élevée après l'IM (supérieure à 30 %) est souvent due à un pneumothorax, à des saignements ou à une grande infarctus27. Ainsi, maintenir les souris sous oxygène continu jusqu'à leur réveil et utiliser un tapis chauffant pour conserver la température corporelle réduit nettement les taux de mortalité. Si la paroi antérieure ne devient pas pâle après la ligature, l'artère coronaire antérieure (LAD) a probablement été mal identifiée ou le point de suture est trop superficiel. Dans ce cas, localiser à nouveau la LAD (un vaisseau rouge vif en diagonale) et repasser l'aiguille à une profondeur de 0,5–1 mm, parfois à l'aide d'un microscope de dissection, permet de résoudre ce problème. En cas de mauvaise qualité du suivi par speckle, les causes habituelles sont une fréquence d'images trop basse, des contours flous ou des artefacts de mouvement28. En conséquence, augmenter la fréquence d'images, régler finement le gain, corriger manuellement le tracé endocardique et rejeter les cycles présentant des arythmies sont des mesures efficaces.
Outre ces considérations opérationnelles, la méthode présente des limites évidentes. Le gène Cracd est inactivé de manière globale, de sorte que CRACD est absent dans tous les tissus. Par conséquent, la protection observée ne peut pas être attribuée exclusivement aux cardiomyocytes, car des contributions systémiques peuvent également jouer un rôle. Un knockout conditionnel serait nécessaire pour distinguer les rôles spécifiques à chaque type cellulaire. Une autre limitation réside dans le seul point temporel analysé, au jour 7 ; ainsi, rien n'est connu sur le remodelage chronique. Par conséquent, des points temporels ultérieurs (4 ou 8 semaines) devraient être ajoutés pour des études à long terme. La reproductibilité dépend aussi de la qualité des images : tous les systèmes d'échographie ne permettent pas d'obtenir des limites endocardiques nettes, et l'expérience de l'opérateur est un facteur déterminant. Il est donc recommandé qu'une personne professionnellement formée réalise toutes les interventions chirurgicales et mesures.
Étant donné ces limites, il est utile de comparer notre approche à d'autres stratégies permettant d'étudier la fonction des gènes dans le remodelage post-infarctus. La modulation génique par AAV et les oligonucléotides antisens (ASO) sont deux alternatives courantes29,30. L'AAV9 permet une surexpression ou une inhibition transitoire spécifique du cœur sans nécessiter de croisement, mais sa limite d'emballage (~4,7 kb), son efficacité de transduction variable et ses effets hors cible en sont des inconvénients31. En revanche, notre modèle d'invalidation par CRISPR/Cas9 offre une perte de fonction permanente et complète, ce qui est avantageux pour les études à long terme. Les ASO permettent une inhibition réversible, dépendante de la dose et à début rapide, ce qui les rend adaptés aux interventions aiguës ; toutefois, ils nécessitent des administrations répétées et manquent de spécificité tissulaire32. Par conséquent, l'invalidation constitutive décrite ici est la mieux adaptée aux découvertes initiales et au phénotypage chronique.
Enfin, ce protocole peut être facilement étendu au-delà du CRACD. Le même flux opératoire — la génération de souris invalidées par CRISPR/Cas9 combinée à l'échocardiographie, à l'imagerie par corrélation de speckle (strain imaging) et à l'histologie — permet d'évaluer n'importe quel gène candidat dans le remodelage post-infarctus du myocarde. Le cadre de phénotypage s'adapte également à d'autres modèles de maladies cardiovasculaires, tels que la constriction aortique transverse (surcharge de pression) ou les lésions d'ischémie-reperfusion. De plus, les échantillons tissulaires obtenus grâce à ce protocole peuvent être utilisés pour des analyses multi-omiques (transcriptomique, protéomique, métabolomique) afin de révéler les mécanismes moléculaires sous-jacents. Le modèle déficient pour Cracd peut servir d'outil pour les tests pharmacologiques : les composés dont on soupçonne qu'ils agissent via la voie CRACD peuvent être évalués. Ainsi, ce protocole constitue une plateforme adaptable à un large éventail d'études mécanistiques et translationnelles en recherche cardiovasculaire.

L'infarctus du myocarde (IM) demeure l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, contribuant ainsi à un fardeau important pour la santé cardiovasculaire mondiale.1Le pronostic à long terme après un infarctus du myocarde est principalement déterminé par le processus de remodelage du ventricule gauche (VG).2, qui implique une dilatation ventriculaire, un amincissement de la paroi et une fibrose interstitielle3,4, qui sont des facteurs clés de la progression vers l'insuffisance cardiaque (IC). L'incidence mondiale de l'IC résultant du remodelage cardiaque post-infarctus aggrave encore la charge de la maladie cardiovasculaire.5Malgré ces observations cliniques bien établies, des études systématiques utilisant des modèles in vivo sensibles et reproductibles afin d'évaluer le rôle de gènes spécifiques dans le remodelage post-infarctus sont actuellement absentes. Aucun protocole ne combine à ce jour un modèle d'invalidation génétique par CRISPR/Cas9 avec un imagerie de déformation cardiaque avancée pour évaluer un régulateur du cytosquelette tel que CRACD. Ainsi, une méthode permettant une manipulation génétique précise et un phénotypage cardiaque à haute résolution est urgemment nécessaire.
Le régulateur de la dynamique de l'actine inhibant la protéine de capuchon (CRACD), également connu sous le nom de KIAA1211, est un régulateur de la polymérisation de l'actine principalement localisé dans le cytosol et jouant un rôle essentiel dans la dynamique du cytosquelette6. Il régule positivement la polymérisation de l'actine en se liant aux protéines de capuchon de l'actine (CAPZA1, CAPZA2, CAPZB) et en les empêchant de se fixer aux extrémités pointues des filaments d'actine7. Dans les tissus épithéliaux, CRACD joue un rôle crucial dans le maintien de la morphologie cellulaire et de la transduction du signal en préservant l'intégrité du cytosquelette d'actine8,9. Dans les cellules tumorales, sa régulation anormale est associée à une augmentation de la métastase et de la prolifération cellulaires6,10. Le rôle de CRACD dans le cœur n'est pas encore entièrement compris. Des études sur le transcriptome cardiaque et des interventions expérimentales montrent que l'expression du gène Cracd répond au stress pathologique et pourrait réguler des gènes liés à la dynamique du cytosquelette lors du remodelage ventriculaire9,11. De plus, sa protéine inhibitrice CapZ est étroitement associée à la pathologie cardiaque : la phosphorylation de CapZ régule la croissance des myofibrilles lors de l'hypertrophie induite par la phényléphrine12. Nos recherches antérieures indiquent qu'une diminution modérée de CRACD confère une protection contre les lésions myocardiques et préserve la contractilité des myofilaments après une ischémie aiguë13. Ces résultats suggèrent que CRACD pourrait jouer un rôle dans le remodelage ventriculaire maladaptatif après un infarctus du myocarde (IM). Toutefois, des études systématiques in vivo de perte de fonction visant à déterminer si le déficit en Cracd module le remodelage post-IM font défaut, principalement en raison de l'absence d'un protocole validé étape par étape permettant de générer et de phénotyper une souris déficiente en Cracd soumise à un stress ischémique.
Plusieurs approches existent pour générer des souris knock-out constitutives. La recombinaison homologue traditionnelle dans les cellules souches embryonnaires (ES) est précise mais coûteuse, longue (12 à 18 mois) et limitée à certaines souches de souris14. La mutagenèse par ENU (N-éthyl-N-nitrosourée) produit des mutations ponctuelles aléatoires nécessitant des rétrocroisements et des séquençages intensifs15. En revanche, CRISPR/Cas9 présente des avantages pratiques distincts pour cette étude : (i) l'injection directe dans les zygotes réduit la durée à 4 à 6 mois ; (ii) elle permet la suppression d'un fragment génomique important (3153 pb) afin d'assurer une perte complète de fonction ; (iii) elle fonctionne directement sur le fond génétique C57BL/6N sans conversion de souche ; et (iv) elle évite l'utilisation d'un marqueur de sélection, minimisant ainsi les interférences transcriptionnelles non voulues. Par conséquent, CRISPR/Cas9 constitue le choix le plus efficace pour générer une lignée déficiente en Cracd, adaptée au phénotypage cardiovasculaire de routine. Cette technologie est largement utilisée pour réaliser des études précises in vivo de perte de fonction16,17.
L'imagerie de déformation par suivi de speckle est une technique de post-traitement qui suit le déplacement des speckles acoustiques naturels au sein du myocarde image par image, permettant ainsi le calcul de paramètres de déformation myocardique tels que la déformation (changement fractionnel de longueur) et la vitesse de déformation (taux de déformation)18. Contrairement à l'échocardiographie en mode M conventionnel ou en deux dimensions, qui fournit des indices fonctionnels globaux (fraction d'éjection, raccourcissement fractionné, diamètre interne du ventricule gauche) et est relativement insensible aux anomalies régionales du mouvement pariétal, l'imagerie de déformation permet de quantifier la fonction contractile segmentaire. Ceci est particulièrement important au cours de la période post-infarctus précoce, où l'hypéricinésie compensatoire des segments non infarcis peut préserver la fraction d'éjection globale malgré une dysfonction régionale significative. Le suivi de speckle présente plusieurs avantages par rapport aux critères d'évaluation classiques : il fournit des mesures de déformation et de vitesse de déformation segmentaires, ainsi que des données de déplacement et de vitesse, permettant ainsi de détecter des modifications subcliniques subtiles19 ; il peut identifier une dyssynchronie et des déficits contractiles précoces avant qu'un remodelage irréversible n'intervienne ; et il explore directement la sous-endocarde, la couche la plus vulnérable à l'ischémie20. Dans cette étude, CRACD est un régulateur du cytosquelette qui pourrait influencer la contractilité des myofibrilles au niveau microscopique. Des mesures conventionnelles basées sur la cavité pourraient facilement manquer de tels effets mécaniques locaux. Ainsi, l'intégration de l'analyse par suivi de speckle dans ce protocole améliore la capacité à détecter les effets protecteurs précoces de la déficience en Cracd. Par conséquent, l'incorporation du suivi de speckle dans ce protocole fournit un outil sensible et quantitatif pour évaluer le remodelage post-infarctus, notamment durant la première semaine suivant l'infarctus du myocarde, lorsque la dilatation précoce et la dysfonction contractile apparaissent21,22.
Ce protocole est conçu pour les chercheurs étudiant l'impact fonctionnel d'une délétion génique spécifique sur le remodelage post-infarctus aigu (7 jours) à l'aide d'une combinaison de souris knock-out constitutif et d'imagerie à haute résolution. Il convient aux études génératrices d'hypothèses dans lesquelles la perte globale du gène cible est acceptable et où le critère principal d'évaluation est la fonction systolique précoce ainsi que les modifications structurelles. Toutefois, plusieurs limites doivent être prises en compte. Premièrement, la souris déficiente pour Cracd est un knock-out global ; par conséquent, les effets cardioprotecteurs observés ne peuvent pas être attribués exclusivement à la perte de CRACD dans les cardiomyocytes, car des contributions systémiques peuvent également jouer un rôle. Des études futures utilisant des stratégies de knock-out conditionnel seront nécessaires afin d'obtenir une délétion spécifique au cœur. Deuxièmement, le protocole se concentre sur un seul point temporel (jour 7) et ne prend pas en compte le remodelage chronique ni la progression vers l'insuffisance cardiaque. Des études longitudinales allant au-delà de la phase aiguë seront requises. Troisièmement, l'analyse par suivi de taches (speckle-tracking) exige des images de haute qualité (bords endocardiques bien définis) et un logiciel dédié, qui ne sont pas toujours disponibles dans toutes les plateformes techniques. Malgré ces limites, le protocole offre une plateforme solide et reproductible pour la caractérisation fonctionnelle initiale de gènes impliqués dans le remodelage cardiaque post-infarctus.
Cette étude visait à utiliser le système CRISPR/Cas9 pour générer et valider un modèle murin déficient pour Cracd (C57BL/6N-Cracdem1 (c.538-83 à c.3352+255 del)) afin d'explorer l'impact de la déficience en Cracd sur le remodelage cardiaque post-infarctus du myocarde (IM) et sur le mouvement de la paroi ventriculaire. Un infarctus du myocarde a été induit chez des souris de type sauvage (WT, C57BL/6N) et chez des souris déficientes en Cracd, et des évaluations complètes ont été réalisées une semaine après l'IM. Les évaluations comprenaient des paramètres échocardiographiques conventionnels, une analyse de la déformation par suivi de taches (speckle-tracking), ainsi qu'une évaluation histopathologique. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur la phase précoce post-IM (jour 7) afin de capturer les événements initiaux de remodelage et de déterminer si la déficience en Cracd affecte la dilatation ventriculaire et la fonction systolique durant la phase aiguë de l'infarctus. Les résultats obtenus devraient fournir des informations précieuses sur le rôle de CRACD dans la modulation du remodelage cardiaque délétère après un infarctus du myocarde.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ACRISPR/Cas9&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de chlorure de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>T2663</td><td>Utilisée pour la préparation du tampon d'extraction d'ADN</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>539480</td><td>Utilisée pour la digestion de la queue de souris</td></tr><tr><td>Green Taq Mix</td><td>Vazyme, Chine</td><td>P131</td><td>Utilisée pour l'amplification par PCR</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioFroxx, Allemagne</td><td>1110GR500</td><td>Utilisée pour l'électrophorèse sur gel d'ADN à une concentration de 1&amp;ndash;2 %</td></tr><tr><td>Marqueur d'ADN</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>SM0242</td><td>Utilisé comme échelle d'ADN pour la détermination de la taille des produits de PCR</td></tr><tr><td>Kit TIANamp d'extraction d'ADN génomique</td><td>Tiangen Biotech, Chine</td><td>DP304</td><td>Utilisé pour l'extraction d'ADN génomique à partir de tissu de queue de souris</td></tr><tr><td>Kit de transcription MEGAshortscript&amp;trade; T7</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>AM1354</td><td>Utilisé pour la transcription in vitro de l'ARN guide (gRNA)</td></tr><tr><td>Kit de purification d'ARN</td><td>Zymo Research, USA</td><td>R1016</td><td>Utilisé pour la purification de l'ARN guide transcrit</td></tr><tr><td>Kit de criblage BeyoCRISPR&amp;trade; sgRNA</td><td>Beyotime, Chine</td><td>D8412S</td><td>Utilisé pour l'évaluation in vitro de l'activité de clivage de l'ARN guide</td></tr><tr><td>Inhibiteur de RNase</td><td>NEB, USA</td><td>M0314</td><td>Utilisé pour prévenir la dégradation de l'ARN pendant la transcription in vitro</td></tr><tr><td>TaKaRa Taq</td><td>Takara Bio, Japon</td><td>R001A</td><td>Utilisé pour le génotypage par PCR de l'ADN de la queue de souris</td></tr><tr><td>Milieu de préincubation des spermatozoïdes FERTIUP&amp;reg; pour souris : PM</td><td>Cosmo Bio, Japon</td><td>KYD-002-EX</td><td>Utilisé pour la capacitation des spermatozoïdes avant la fécondation in vitro</td></tr><tr><td>Kit T7 ARCA mRNA</td><td>NEB, USA</td><td>E2060</td><td>Utilisé pour la transcription in vitro de l'ARN messager de Cas9</td></tr><tr><td>Gonadotrophine sérique de jument enceinte</td><td>MCE, USA</td><td>9002-70-4</td><td>Utilisée pour l'hyperovulation, administrée par injection intrapéritonéale</td></tr><tr><td>Gonadotrophine chorionique humaine</td><td>ProSpec, Israël</td><td>HOR-250</td><td>Utilisée pour induire l'ovulation, administrée par injection intrapéritonéale</td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Aladdin, Chine</td><td>R665526</td><td>Utilisée pour la dissolution de l'ARN et la préparation des réactions de PCR</td></tr><tr><td>Amorces</td><td>Sangon Biotech, Chine</td><td>/</td><td>Utilisées pour le génotypage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chirurgie&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science, Chine</td><td>R510-22-10</td><td>Utilisé pour l'induction et le maintien de l'anesthésie pendant la chirurgie</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet, France</td><td>1000207</td><td>Appliquée sur la région thoracique pour éliminer le pelage avant la chirurgie et l'échographie</td></tr><tr><td>Fil de suture 7-0</td><td>Lingqiao, Chine</td><td>LQ7022380206</td><td>Utilisé pour la ligature permanente de l'artère coronaire antérieure descendante (LAD)</td></tr><tr><td>Fil de suture 4-0</td><td>Lingqiao, Chine</td><td>LQ4022380412</td><td>Utilisé pour la fermeture de l'incision cutanée après la chirurgie</td></tr><tr><td>Ventilateur d'anesthésie</td><td>Harvard Apparatus, USA</td><td>Tabletop</td><td>Utilisé pour délivrer l'isoflurane et assister la respiration</td></tr><tr><td>Ventilateur pour petit animal</td><td>Taimeng, Chine</td><td>HX-101E</td><td>Utilisé pour fournir une ventilation en pression positive pendant la chirurgie à cœur ouvert</td></tr><tr><td>Plaque chauffante à température constante</td><td>TigerGene, USA</td><td>TG-TP-GS</td><td>Utilisée pour maintenir la température corporelle de la souris pendant la chirurgie et la récupération</td></tr><tr><td>Écarteur costal</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chine</td><td>LN-18-4101</td><td>Utilisé pour écarter les côtes et exposer le cœur pour la ligature de l'artère LAD</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chine</td><td>18-0551</td><td>Utilisés pour réaliser les incisions cutanées et couper les tissus</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Nikon, Japon</td><td>SMZ 745</td><td>Utilisé pour fournir une vue agrandie pendant la chirurgie de ligature de l'artère LAD</td></tr><tr><td>Pince à aiguille microscopique</td><td>Shenzhen Huayon Biotech, Chine</td><td>18-2211</td><td>Utilisée pour manipuler l'aiguille fine de suture 7-0 sous microscope</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Produits chimiques et réactifs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agents de couplage ultrasonore</td><td>Tianjin Jinya Technology Development, Chine</td><td>TM-100</td><td>Appliqués sur le thorax pour l'échocardiographie, assurent un bon contact de la sonde</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>V900894</td><td>Utilisé pour la fixation du tissu cardiaque après prélèvement</td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Macklin, Chine</td><td>1330-20-7</td><td>Utilisé pour l'élimination de la paraffine et la clarification des tissus avant coloration</td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3136</td><td>Colorant nucléaire, utilisé dans la coloration HE</td></tr><tr><td>Éosine</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>E4009</td><td>Colorant cytoplasmique, utilisé dans la coloration HE</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P3504</td><td>Utilisé dans la coloration de Masson pour la coloration du cytoplasme</td></tr><tr><td>Acide phosphomolybdique</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>221856</td><td>Utilisé dans la coloration de Masson comme mordant et pour la différenciation</td></tr><tr><td>Solution de bleu d'aniline</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>415049</td><td>Utilisée dans la coloration de Masson pour la coloration des fibres de collagène (en bleu)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CRACD</td><td>Absea, Chine</td><td>KC-35356</td><td>Anticorps primaire pour la détection de la protéine CRACD par Western Blot, dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>CST, USA</td><td>2118S</td><td>Anticorps de contrôle de chargement pour Western Blot, dilution 1:5000</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Macklin, Chine</td><td>64-17-5</td><td>Utilisé pour la déshydratation et la préparation des réactifs (concentrations 70 %, 80 %, 95 %, 100 %)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Équipements de laboratoire&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall&amp;trade; Legend&amp;trade; Micro 17</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>75002541</td><td>Utilisée pour la préparation courante des échantillons</td></tr><tr><td>Cycleur thermique pour PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories, USA</td><td>1861096</td><td>Utilisé pour l'amplification de l'ADN</td></tr><tr><td>Système de microinjection</td><td>Eppendorf, Allemagne</td><td>5193000020</td><td>Utilisé pour la microinjection des réactifs CRISPR/Cas9 dans les zygotes</td></tr><tr><td>Système d'imagerie Vevo 2100</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>Vevo2100</td><td>Système d'imagerie à haute fréquence pour l'évaluation non invasive de la fonction et de la structure cardiaques après infarctus du myocarde</td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Leica, Allemagne</td><td>DM2500</td><td>Utilisé pour l'observation des coupes cardiaques colorées à l'HE et à la Masson</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Logiciels d'analyse&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>/</td><td>Utilisé pour l'analyse d'images, y compris la mesure des surfaces, la quantification de signaux et le traitement des images histologiques (colorations HE et Masson)</td></tr><tr><td>VevoLab 3.2.0 / VevoStrain</td><td>VisualSonics, Canada</td><td>/</td><td>Logiciel VevoLab pour l'analyse de la fonction cardiaque ; module VevoStrain utilisé pour l'analyse de la déformation myocardique afin d'évaluer la performance cardiaque après infarctus du myocarde</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad Software, USA</td><td>/</td><td>Utilisé pour l'analyse statistique et la préparation des graphiques</td></tr></tbody></table>

génération et caractérisation phénotypique d'un modèle murin déficient pour cracd, conçu à l'aide de crispr/cas9, pour l'étude du remodelage post-infarctus du myocarde

Generation and Phenotypic Characterization of a CRISPR/Cas9-Engineered Cracd-Deficient Mouse Model for Post-Myocardial Infarction Remodeling Studies

Myocardial infarction (MI) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. This protocol describes a method for generating and characterizing a Cracd-deficient mouse line on the C57BL/6N background using CRISPR/Cas9 technology. Zygotes were co-injected with Cas9 mRNA, a gRNA construct, and a donor template designed to generate a 3153-bp genomic deletion. The edited allele was confirmed by PCR genotyping and Sanger sequencing. To assess the functional role of CRACD in post-MI remodeling, Cracd-deficient and wild-type (WT, C57BL/6N) mice underwent MI induced by permanent ligation of the left anterior descending coronary artery. On postoperative day 7, cardiac function and left ventricular wall motion were assessed using transthoracic echocardiography and speckle-tracking strain imaging, followed by histopathological evaluation with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Representative results showed that Cracd-deficient mice exhibited reduced ventricular dilation and preserved systolic function compared to WT controls. This protocol provides a reliable experimental platform for mechanistic studies of CRACD in cardiac pathophysiology.

Generation of Cracd-deficient mice
A heritable mouse model carrying a targeted deficiency in the Cracd gene was generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing (Figure 1A, Figure 1B). To distinguish WT, heterozygous, and homozygous genotypes, a multiplex PCR was performed using three primers (F1, F2, R1) in a single reaction. Mice homozygous for the deletion (Cracd&#8209;deficient) displayed only the 421 bp band, WT mice showed only the 357 bp band (Figure 1C). Sanger sequencing of genomic DNA from Cracd-deficient mice confirmed the predicted deletion in the target gene compared to WT controls (Figure 1D). Western blot analysis further demonstrated a marked reduction in CRACD protein levels in cardiac tissues from Cracd-deficient mice compared with WT controls (Figure 1E). Together, these data confirm the successful establishment of the Cracd-deficient mouse line.
Echocardiography
Echocardiographic assessment on postoperative day 7 revealed pronounced pathological cardiac remodeling in WT mice after MI (WT-MI) compared with sham-operated controls (Figure 2A). The WT-MI group showed thinning of the interventricular septum (Figure 2B, C), significant left ventricular (LV) dilation as reflected by increased LVIDd (Figure 2D) and LVIDs (Figure 2E), and thinning of the posterior wall (Figure 2F, G). These structural alterations were associated with a pronounced decline in global systolic function, as demonstrated by significantly reduced EF (Figure 2H) and FS (Figure 2I). In contrast, Cracd-deficient mice displayed a cardioprotective phenotype following MI. LV dilation was significantly attenuated, with notably smaller LVIDd and LVIDs compared with the WT-MI group. Furthermore, these mice exhibited improved systolic thickening of the posterior wall and maintained significantly higher EF and FS values. These findings indicate that Cracd deficiency effectively attenuates post-infarction LV dilation and preserves global systolic function.
Speckle-tracking strain analysis
Left ventricular myocardial motion and deformation were further evaluated by speckle&#8209;tracking echocardiography using only parasternal long&#8209;axis views (Figure 3A). To ensure data reliability, we defined pragmatic criteria for acceptable output based on the capabilities of the VevoStrain software. Acceptable strain analysis required: (i) a clear parasternal long&#8209;axis view with endocardial borders visible throughout the cardiac cycle; (ii) a stable heart rate between 450&#8211;550 bpm during acquisition; (iii) after automatic tracking, the colour&#8209;coded mesh (activated via &#8220;toggle contour/vector/orbit line/B mode&#8221;) had to closely follow the endocardial and epicardial borders without jerking or losing contact; and (iv) strain curves had to be smooth, show consistent waveforms across segments, and lack sudden spikes or arrhythmic interruptions. Suboptimal output&#8212;most commonly erratic strain curves or inability to visualise clear motion trajectories&#8212;led to manual adjustment of endocardial or epicardial contours and re&#8209;analysis. If quality remained poor after three attempts, the mouse was excluded. Using these criteria, we obtained reliable strain data in WT&#8209;MI mice and Cracd&#8209;deficient MI mice.
Compared with the sham group, WT-MI mice exhibited significantly reduced radial velocity (Figure 3B) and longitudinal velocity (Figure 3C), as well as radial displacement (Figure 3D) and longitudinal displacement (Figure 3E), indicating impaired global myocardial motion. The absolute values of radial strain (Figure 3F), radial strain rate (Figure 3G), longitudinal strain (Figure 3H), and longitudinal strain rate (Figure 3I) were also markedly decreased, reflecting severely compromised regional myocardial deformation and function. In contrast, Cracd-deficient mice showed significant improvement in these parameters. Compared with the WT-MI group, they displayed better recovery of radial and longitudinal displacements. Furthermore, radial velocity, radial strain, and radial strain rate were maintained at higher levels, while longitudinal strain and longitudinal strain rate were significantly improved. These results suggest that Cracd deficiency not only preserves global systolic function but also enhances regional LV myocardial deformation after MI.
The speckle&#8209;tracking imaging analysis also included visualization of segmental strain distribution and cardiac motion trajectories. Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images with segmented six regions (BA, MA, AA, AP, MP, BP) and color gradient mapping are displayed in Figure 4A. Cardiac motion trajectories, time&#8209;to&#8209;peak curves for radial and longitudinal strain, parametric distribution maps of strain synchrony, and three&#8209;dimensional reconstructions are presented in Figure 4B. These data further support the functional improvements observed in Cracd&#8209;deficient mice.
Histological examination
To assess the protective effect of Cracd deficiency against MI, histopathological examination was performed on heart sections from WT and Cracd-deficient mice at 7 days post-MI using H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Whole&#8209;heart longitudinal sections are shown in Figure 5A, with quantitative analysis of infarct size and collagen content presented in Figure 5B and Figure 5C, respectively. High&#8209;magnification views of the infarct zone, border zone, and remote zone are displayed in Figure 5D. In WT-MI hearts, H&#38;E staining showed pronounced left ventricular wall thinning and a well-demarcated infarct zone. Within the infarct region, extensive inflammatory cell infiltration, myocardial necrosis, and marked fibrosis with scar formation were observed. In the border zone, inflammatory infiltration, myocardial necrosis, fibrosis and cardiomyocyte hypertrophy were evident, while the remote zone displayed prominent hypertrophic changes. Corresponding Masson&#39;s trichrome staining further demonstrated extensive interstitial fibrosis within both the infarct and border zones of WT hearts following MI. In contrast, Cracd-deficient mice exhibited substantially attenuated pathological alterations, including reduced wall thinning, diminished inflammatory infiltration and myocardial necrosis, less pronounced cardiomyocyte hypertrophy, and markedly decreased interstitial fibrosis compared with WT-MI hearts. These histological findings indicate that Cracd deficiency mitigates post-infarction myocardial damage and adverse remodeling.
Successful protocol execution should yield: (i) a well&#8209;demarcated infarct zone with extensive collagen deposition in WT-MI hearts; (ii) clear cellular morphology without staining artifacts; and (iii) significantly attenuated pathology in Cracd&#8209;deficient MI hearts. Although infarct size may vary with ligation precision, the genotype&#8209;dependent difference is a reliable indicator of successful performance.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig1c1.jpg" /> 
Figure 1: Generation of Cracd-deficient mice. (A) Construction of Cracd-deficient mice. (B) Schematic of the Cracd gene modification strategy. (C) PCR genotyping of tail genomic DNA. WT mice show a single 357 bp band, while homozygous (Cracd&#8209;deficient) mice show a single 421 bp band. (D) Sanger sequencing of genomic DNA confirmed the predicted deletion in the Cracd locus of deficient mice compared to WT controls. (E) Western blot analysis showed significantly reduced CRACD protein levels in the hearts of Cracd-deficient mice compared to WT controls. n = 6 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was calculated with a two-tailed unpaired Student&#39;s t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig2c1.jpg" /> 
Figure 2: Echocardiographic assessment of cardiac function. (A) Representative B-mode and M-mode echocardiographic images of mouse hearts at diastole and systole. Quantitative analysis of (B) interventricular septum thickness at diastole (IVSd) and (C) systole (IVSs), (D) left ventricular internal diameter at diastole (LVIDd) and (E) systole (LVIDs), (F) left ventricular posterior wall thickness at diastole (LVPWd) and (G) systole (LVPWs), (H) ejection fraction (EF), and (I) fractional shortening (FS). n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig2largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig3c1.jpg" /> 
Figure 3: Speckle-tracking strain analysis. (A) Representative images of left ventricular wall motion and deformation at diastole and systole. Quantitative analyses of the following parameters: (B) radial velocity, (C) longitudinal velocity, (D) radial displacement, (E) longitudinal displacement, (F) radial strain, (G) radial strain rate, (H) longitudinal strain, and (I) longitudinal strain rate. n = 10 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig4d1.jpg" /> 
Figure 4: Speckle-tracking imaging in WT-Sham, WT-MI, Cracd-deficient Sham, and Cracd-deficient MI groups at 7 days post-MI. (A) Parasternal long&#8209;axis B&#8209;mode images. Left ventricular wall was segmented into six regions: BA (basal anterior), MA (mid anterior), AA (apical anterior), AP (apical posterior), MP (mid posterior), and BP (basal posterior). Color gradient from blue to red represents increasing strain magnitude. (B) Cardiac motion trajectories; time-to-peak curves for radial and longitudinal strain values along with corresponding peak times. Parametric distribution maps of strain synchrony (blue/red indicate direction: radial &#8211; away from/toward center; longitudinal &#8211; away from/toward apex). White dots = highest velocity regions, black dots = lowest velocity. Three-dimensional reconstructions (X: time, Y: spatial position, Z: strain magnitude). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig4larged1.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71451/71451fig5c1.jpg" /> 
Figure 5: Histopathological analysis of cardiac remodeling after MI. (A) Whole-heart longitudinal sections with H&#38;E and Masson&#39;s trichrome staining. Scale bars: 2 mm. (B) Quantitative analysis of infarct size and (C) collagen content. (D) High&#8209;magnification views of infarct zone (IZ), border zone (BZ), and remote zone (RZ). H&#38;E: yellow circles = inflammatory infiltration; black arrows = myocardial necrosis; green stars = fibrosis; blue arrows = hypertrophy. Masson&#8217;s trichrome:&#160;blue indicates collagen deposition. Scale bar: 50 &#956;m. n = 5 mice per group. Data are presented as mean &#177; SEM. Statistical significance was determined by one-way ANOVA followed by Tukey&#39;s multiple comparisons test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71451/71451fig5largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Ce protocole décrit la génération et la caractérisation phénotypique d'un modèle murin C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) à l'aide de la technologie CRISPR/Cas9 afin d'étudier le rôle de CRACD dans le remodelage cardiaque après un infarctus du myocarde.

Génération et caractérisation phénotypique d'un modèle murin déficient pour Cracd, conçu à l'aide de CRISPR/Cas9, pour l'étude du remodelage post-infarctus du myocarde

L'infarctus du myocarde (IDM) demeure une cause majeure de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale. Ce protocole décrit une méthode pour générer et caractériser...

We study how Cracd-deficiency influences heart remodeling and function after myocardial infarction using a Cracd-deficient mouse model. This protocol can be applied to study gene functions in post-MI cardiac remodeling by combining CRISPR knockout with vivos during imaging. To begin, use CRISPR-Cas9 gene editing technology to generate Cracd-deficient mice on a C57BL/6N background.Place the anesthetized mice in a supine position on a surgical platform and confirm deep anesthesia by the absence of the pedal withdrawal reflex. Then perform orotracheal intubation using a 20 gauge intravenous catheter sheath. Place a small tuft of cotton wool at the opening of the tube to confirm successful intubation as it moves rhythmically with the mouse's breathing.Connect the tube to a mechanical ventilator upon successful intubation to maintain ventilation and anesthesia with 2%isoflurane. Apply ophthalmic ointment to both eyes to prevent corneal drying. Then remove the hair from the anterior chest using a depilatory cream and disinfect the surgical area by applying povidone iodine and 70%alcohol multiple times.After fully exposing the skin, make a 1 to 1.5 centimeter incision in the left chest wa

generation-phenotypic-characterization-crisprcas9-engineered-cracd

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Nous introduisons une méthode chirurgicale pour induire expérimental d'ischémie / reperfusion (I / R) des blessures pour simuler un infarctus du myocarde (IM) dans les modèles de souris qui permet une plus grande clarté dans le positionnement de la ligature sur l'artère interventriculaire antérieure gauche (LAD) d'augmenter la reproductibilité d'expériences MI chez la souris.

Un modèle murin d&#39;ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l&#39;artère interventriculaire antérieure

L’insuffisance cardiaque est la principale cause d’hospitalisation et une cause majeure de mortalité. Un modèle de ligature permanente de l’artère coronaire descendante antérieure gauche chez la souris est appliqué pour étudier le remodelage ventriculaire et le dysfonctionnement cardiaque après un infarctus du myocarde. La technique des mesures hémodynamiques invasives chez la souris est présentée.

Ligature permanente de l&#39;artère interventriculaire antérieure coronaire chez la souris: Un modèle de post-infarctus du myocarde et de remodelage de l&#39;insuffisance cardiaque

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour réaliser en vivo gène cardiaque édition chez la souris à l’aide de Virus recombinant de Adeno-Associated (rAAV)-mediated livraison de CRISPR. Ce protocole propose une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter la cardiomyopathie dystrophique dans la dystrophie musculaire de Duchenne et peut être utilisé pour générer des knockout spécifique cardiaque chez les souris après la naissance.

Adéno-associés de livraison induite par le Virus de CRISPR gène cardiaque édition chez la souris

Ici nous décrivons une procédure chirurgicale montrant comment réaliser la ligature permanente de l'artère coronaire descendante gauche-antérieure chez les souris. Ce modèle est d'une grande pertinence pour étudier la pathophysiologie de l'infarctus du myocarde et les processus biologiques concomitants.

Modèle d'infarctus myocarde de Murine utilisant la ligation permanente de l'artère coronaire descendante antérieure gauche

Cet article démontre un modèle pour étudier le remodelage cardiaque après cryoinjury myocardique chez les souris.

Un modèle cryo-blessure pour étudier l'infarctus du myocarde chez la souris

Ce protocole présente une façon simple et cohérente de mettre en place transitoirement un gène d’intérêt à l’aide de modRNA après l’infarctus du myocarde chez la souris.

Livraison de l’ARNm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde

Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle...

Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

Il existe plusieurs différences entre les ventricules droit et gauche. Cependant, la physiopathologie de l’infarctus du ventriculaire droit (IRV) n’a pas été clarifiée. Dans le présent protocole, une méthode reproductible pour la génération de modèles de souris RVI est introduite, ce qui peut fournir un moyen d’expliquer le mécanisme de RVI.

Génération et caractérisation de l’infarctus du myocarde ventriculaire droit induit par la ligature permanente de l’artère coronaire droite chez la souris

Ce protocole décrit une approche visant à faciliter des modifications précises dans les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un pipeline de phénotypage est présenté pour démontrer l’applicabilité de ces techniques à modéliser une variante génétique associée au syndrome du QT long.

Modifications précises de CRISPR-Cas9 dans les cœurs de poisson zèbre

Photothrombosis est une technique rapide, peu invasive pour induire petite et bien délimitée du myocarde dans les domaines d'intérêt de façon très reproductible. Il est particulièrement adapté pour étudier les réponses cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la plasticité du cerveau chez les souris transgéniques.

Ischémie Photothrombotic: A photochimique modèle de lésion corticale minimalement invasive et reproductible pour les études de course de souris

Guangdong Provincial Biotechnology Research Institute (Guangdong Provincial Laboratory Animals Monitoring Center).  This protocol describes the generation and phenotypic characterization of a C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) mouse model using CRISPR/Cas9 technology to study the role of CRACD in cardiac remodeling following myocardial infarction.

Génération et caractérisation phénotypique d'un modèle murin déficient pour Cracd, conçu à l'aide de CRISPR/Cas9, pour l'étude du remodelage post-infarctus du myocarde

Explorer plus de vidéos