Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Les mitochondries jouent de nombreux rôles dans la physiologie cellulaire, allant du métabolisme et de la production d'énergie à la mort cellulaire programmée et à la synthèse des hormones stéroïdiennes. Malgré l'importance des mitochondries dans les fonctions cellulaires fondamentales ainsi que dans les maladies, très peu de choses sont connues sur la fonction mitochondriale dans les cellules souches embryonnaires humaines et leurs descendants différenciés. Dans cette vidéo, nous vous montrerons comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysés à l'aide de dosages d'activité en gel.

Bonjour, je suis Ivan OV du laboratoire de Michael Tetel, Département d'anatomie et de médecine de laboratoire à l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'évaluer la fonction des complexes respiratoires mitochondriaux dans les cellules souches embryonnaires humaines. Cette évaluation de l'activité in gel consiste à isoler un pellet mitochondrial brut à partir de cellules souches embryonnaires humaines, à séparer les complexes mitochondriaux du système de phosphorylation oxydative par électrophorèse native sur gel de polyacrylamide à haute résolution, puis à réaliser une détection in gel de l'activité enzymatique.

Commençons. La première étape de cette procédure consiste à isoler les mitochondries à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Pour ce dosage, nous utiliserons des cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une plaque recouverte de matrigel, dans des conditions sans cellules nourricières.

Pour recueillir des mitochondries à partir de nos cellules souches humaines, nous commençons par les laver avec du PBSDX à 1x, à 37 °C et de pH 7,4, puis nous soumettons les cellules à une action de la trypsine pendant cinq minutes. Vous pouvez utiliser un millilitre de trypsine 1x par puits dans une plaque de six puits. Après cinq minutes, vous pouvez arrêter la réaction en ajoutant un volume égal d'inhibiteur de trypsine frais (1 milligramme par millilitre) dans du PBS 1x, puis récolter les cellules.

Les cellules recueillies sont ensuite centrifugées à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et resuspendez les cellules en culot dans 0,8 à 1,7 millilitre de tampon d'isolement de mitochondries glacé contenant un cocktail fraîchement préparé d'inhibiteurs de protéases à 1×. La quantité de tampon utilisée dépend de la taille du culot cellulaire obtenu. Une fois le culot resuspendu, incubez-le sur de la glace pendant environ 10 minutes.

Après l'incubation, nous lysons les cellules à l'aide d'un homogénéisateur, ce qui peut nécessiter environ 40 à 50 mouvements. Nous pouvons vérifier l'achèvement complet de l'homogénéisation en colorant un aliquot des cellules DOD au bleu de trypan et en les examinant au microscope optique. Le résultat devrait ressembler à ceci.

Ceci est la première prise après 50 coups avec un downs. Ceci est la deuxième prise après 80 coups avec un downs. Une fois les cellules homogénéisées, centrifuger à 20 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés C. Cela nous donnera un culot mitochondrial brut, qui contiendra également des noyaux et des fragments cellulaires plus gros.

Avant la collecte du culot, il faut peser le tube de collecte afin d'estimer le poids du culot ultérieur, verser et éliminer le surnageant, puis peser le culot brut de mitochondries précipité. En soustrayant le poids du tube à ce stade, on peut passer à la solubilisation du culot, ce qui sera montré à l'étape suivante. Pour solubiliser le culot mitochondrial brut, on commence par maintenir le culot sur glace et par vortexer avec 35 microlitres de tampon de solubilisation glacé.

Pour chaque 20 milligrammes de culot, des informations détaillées sur les composés tampons sont indiquées dans le protocole écrit joint. Après vortexage et ajout du tampon de solubilisation, et avant d'ajouter la digitonine, nous transférons le culot resuspendu dans un tube adapté à une centrifugation à haute vitesse, puis nous ajoutons 20 microlitres de digitonine à 10 % poids/volume pour 20 milligrammes de masse de culot, et nous mélangeons en tapotant le tube. Après un mélange complet, nous incubons le culot mitochondrial pendant cinq à dix minutes sur de la glace. Le Doil bêta D multiside ou le DDM ou le Triton X-100 peuvent être utilisés en remplacement de la digitonine pour solubiliser les protéines.

Le choix du détergent et de sa quantité peut influencer la formation de supercomplexes ou de formes multimériques des complexes mitochondriaux après l'incubation sur glace. Une fois que le culot a été solubilisé, nous le centrifugeons à cent mille fois g pendant 15 minutes à quatre degrés C, puis nous récupérons le surnageant clair. Nous sommes maintenant prêts à préparer le surnageant pour son dépôt sur notre gel en gradient destiné à l'électrophorèse native en gradient de gels des mitochondries.

Nous recommandons d'utiliser un gel de gradient d'acrylamide allant de 5 à 13 % avec un gel de concentration de 3,5 %. Pour préparer le gel, nous utiliserons un mélange d'acrylamide-bisacrylamide tel que décrit dans le protocole écrit. La solution d'acrylamide-bisacrylamide est préparée à l'avance et conservée à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.

L'acrylamide et la bis-acrylamide sont des produits chimiques toxiques, tant sous forme de poudre que sous forme liquide, il convient donc d'être particulièrement prudent lorsqu'on les manipule. Nous combinons la solution d'acrylamide-bis-acrylamide avec un aliquot d'un tampon gel trois fois composé d'acide 1,6-hexanediamino à 1,5 molaire et de 75 millimolaire d'oléate à un pH de 7,0. La quantité de solution d'acrylamide-bis-acrylamide que nous ajoutons au tampon dépendra du pourcentage de gel que nous préparons pour réaliser le gel en gradient.

Nous préparerons un mélange à 4 % et un mélange à 13 %, et le gel de concentration sera un mélange à 3,5 %. N'oubliez pas d'ajouter du glycérol au mélange à 13 %. Lorsque les trois mélanges sont prêts, nous ajoutons une quantité appropriée de persulfate d'ammonium et de TEMED aux mélanges, puis nous les versons dans la chambre de coulée d'un formateur de gradient.

La partie gauche de la chambre contient le mélange à 5 %. La partie droite de la chambre contient le mélange à 13 % avec une petite barre magnétique d'agitation. Nous commençons à verser le gel en ouvrant la partie droite de la chambre.

Ensuite, nous ouvrons immédiatement la partie gauche de la chambre et laissons la solution à 5 % se mélanger à une solution à 13 % afin de former le gradient. Nous ajoutons une petite quantité d'isopropanol au sommet du gel pour obtenir une frontière nette et droite après la polymérisation. Environ une heure plus tard, lorsque la polymérisation du gel gradient est terminée, nous retirons l'isopropanol et ajoutons le gel de concentration à 3,5 % dans l'appareil, puis insérons un peigne à gel.

Nous assemblerons et ferons fonctionner les gels dans une chambre froide d’environ quatre à sept degrés Celsius. Pour faire fonctionner ce gel, nous utiliserons deux tampons différents. Dans la chambre de l’anode, nous utiliserons un tampon contenant de l’acide chlorhydrique à 25 millimolaire, pH 7,0.

Le tampon cathodique contiendra 50 millimètres tric, 7,5 millimolaire olé hydrochlorure, 0,02 % poids par volume, doïl bêta D multiside ou DDM et 0,05 % poids par volume, désoxy coate pH 7,0. Afin de préparer le surnageant à déposer sur le gel que nous venons de couler, on ajoute un tampon de charge pour obtenir une concentration finale de 5 % poids par volume de glycérol et de 0,01 % poids par volume. Ponto S, nous ajoutons généralement une solution mère 10 x contenant du glycérol et du poncho s directement aux surnageants.

Nous sommes maintenant prêts à charger l'échantillon sur le gel. Nous chargerons les puits du gel avec un volume contenant de 20 à 40 milligrammes de protéines mitochondriales brutes par lane. Immédiatement après le chargement, le gel est électrophoré à 100 volts.

Une fois que l'échantillon est entré dans le gel de concentration, la tension peut être augmentée à 500 volts, le courant étant limité à 15 milliampères. Bien que nous ayons l'habitude de faire migrer le gel toute la nuit à une tension de 70 à 100 volts, nous arrêtons l'électrophorèse lorsque une ligne nette du colorant rouge zos approche du front du gel. Maintenant que le gel a été parcouru, nous pouvons analyser l'activité des différents complexes protéiques directement dans le gel.

La durée d'incubation pour chaque test dépend de l'efficacité de la solubilisation des protéines et de la quantité de matériau chargée par puits. Les complexes un, quatre et cinq produisent généralement des signaux plus intenses que les complexes deux et trois. C'est pourquoi le temps de coloration pour les complexes deux et trois doit être plus long.

Pour tester l'activité du complexe, nous devrons utiliser des tampons spécifiques pour chaque complexe. Vous trouverez les ingrédients des tampons individuels dans le protocole écrit. Nous allons maintenant découper les bandes individuelles du gel afin de réaliser séparément les tests d'activité en gel.

Pour tous les complexes, incuber le morceau de gel dans leurs tampons respectifs plusieurs heures à température ambiante, pour tous les complexes sauf le complexe cinq. Après l'incubation, fixer le gel dans 50 % méthanol et 10 % acide acétique pendant 15 à 45 minutes. Le gel fixé est conservé dans 10 % acide acétique.

Vous voyez ici à quoi ressemble la coloration du complexe I. On observe une bande d'un violet foncé dans la tranche de gel, correspondant au complexe I. Les gels transparents permettent d'effectuer une densitométrie des activités des complexes mitochondriaux et de réaliser des analyses comparatives.

Après la cytométrie dense, nous séchons généralement les tranches de gel pour un stockage à long terme et/ou pour une numérisation afin d'obtenir une image de haute qualité. Deux complexes présentent la même couleur violette, tandis que le complexe trois et le complexe quatre donnent tous deux une bande colorée en orange ou jaunâtre. Voici des exemples d'activités de coloration des complexes deux, trois et quatre.

Nous venons de vous montrer comment analyser l'activité des complexes d'exsudation mitochondriaux, extraits de cellules souches embryonnaires humaines et séparés par une résolution plus élevée, y compris l'électrophorèse sur gel natif. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.