Name: Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Découvrez l'analyse des complexes respiratoires mitochondriaux dans les cellules souches embryonnaires humaines par électrophorèse native et tests d'activité in gel. Cette méthode permet d'évaluer la fonction mitochondriale.

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Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont actuellement pris en charge par une California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions le Dr Carla Koehler (UCLA) et des membres du laboratoire Koehler de fournir des conseils et des idées dans ces domaines et des études supplémentaires.

Haute Résolution électrophorèse sur gel natif Effacer (hrCNE) pour le complexe mitochondrial tests d&#39;activité dans le gel Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont été maintenus sur une monocouche de ˠ-irradiés ou la mitomycine C fibroblastes de souris traitées embryonnaires (MEF), puis passer à la croissance sur Matrigel pendant 5 jours dans MEF milieu conditionné utilisant des conditions standard. Pour enlever la contamination FAE, CSEh ont été re-plaquées sur Matrigel et cultivées en milieu conditionné MEF pour les 3 jours supplémentaires. Immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence Oct-4, SSEA-4 a été utilisé pour confirmer l&#39;absence de différenciation des CSEh. <ol><li> Laver les cellules avec des chaudes 1x PBS, pH 7,4, suivis par trypsinisation (1ml de la trypsine 1x par puits dans une plaque à 6 puits) pendant 5 min. </li><li> Ajouter un volume égal d&#39;inhibiteur de trypsine frais (1mg/ml dans du PBS 1X, pH 7,4). Récolte des cellules et centrifuger à 200 g, 5 min, la température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant et remettre les cellules granulées de 0,8 - 1.7ml (basée sur la taille du culot cellulaire) de glace isolée tampon froid mitochondries (83mm saccharose; 6.6mm imidazole / HCl, pH 7,0) avec 1 fraîchement préparés &quot;cocktail inhibiteur de protéase. Incuber sur la glace pendant 10 min. </li><li> Dounce cellules avec un homogénéisateur (~ 40 - 50 coups). Stain une aliquote de cellules dounced bleu trypan pour vérifier l&#39;exhaustivité de l&#39;homogénéisation à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. </li><li> Centrifuger à 20000 g pendant 10 min à 4 ° C pour obtenir un brut mitochondrial granulés qui contient également des noyaux et des fragments de cellules plus grandes. Décanter et jeter le surnageant et peser le précipité brut mitochondrial granulés. Le culot peut être conservé à -80 ° C après la congélation instantanée dans l&#39;azote liquide, si ce n&#39;est un point d&#39;arrêt. REMARQUE: centrifugation différentielle ou d&#39;autres basées sur les gradients procédures peuvent être utilisées pour isoler et de percevoir une fraction de membrane mitochondriale pures. Voir réf. 4 pour les détails. Cette approche alternative sera le rendement de l&#39;activité mitochondriale complexes par mg de protéine mitochondriale lieu d&#39;activité complexe par mg de poids cellulaire ou un numéro de cellulaire. La concentration de protéines mitochondriales devra être déterminé après la purification de faire cette comparaison. En outre, un tampon d&#39;isolement différent peut être requis pour cette approche. Pour la solubilisation de la fraction de la membrane mitochondriale pur, voir la note suivante étape 6 ci-dessous. </li><li> Solubiliser le brut mitochondrial granulés sur la glace au vortex avec un tampon de solubilisation de la glace froide (50 mM NaCl, 50 mM imidazole / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM d&#39;acide 6-aminohexanoïque). L&#39;acide 6-aminohexanoïque peut être remplacé par le cocktail d&#39;inhibiteur de protéase 1x. Utilisez 35μl de tampon de solubilisation par 20mg de poids à granulés. Ajouter 20 pi de 10% p / v digitonine par 20mg de poids granulés et mélanger en feuilletant le tube. Incuber 5-10 min sur la glace. Dodécyl-bD-maltoside ou le Triton X-100 peut être substitué à la digitonine pour solubiliser les protéines. Le choix du détergent et de sa quantité peuvent affecter la formation de formes multimériques supercomplexes ou des complexes mitochondriaux. Pour plus d&#39;informations, consultez ref.1. REMARQUE: La quantité de détergent nécessaire pour solubiliser une fraction membranaire mitochondrial pur correspond à un ratio poids du détergent / protéine allant de 2 à 6g / g. Le rapport optimal pour solubiliser les membranes mitochondriales est 2.5g / g pour dodécyl-bD-maltoside, 3g / g pour le triton X-100, et 6g / g pour la digitonine. </li><li> Centrifuger le culot solubilisé à 100.000 g pendant 15 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant clair. </li><li> Ajouter un tampon de charge à une finale de 5% p / v de glycérol et 0,01% p / v Ponceau S (utilisation de 50% p / v de glycérol, 0,1% w / v de solution de chargement Ponceau S stock tampon). </li><li> Charger des puits du gel avec un volume qui contient 20-40mg du brut culot de mitochondries par voie. Utilisez un gel à gradient d&#39;acrylamide (4 -13%) avec un empilage de 3,5% de gel. REMARQUE: préparation de gel et les conditions de l&#39;électrophorèse: Pour la préparation du gel, utiliser un acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mélanger comme suit: 48g d&#39;acrylamide et 1,5 g de bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Si T est la concentration totale d&#39;AA et bisAA et C est le pourcentage de réticulant (bisAA) au total des monomères). Gel de tampon (3 &#39;): 1,5 M acide 6-aminohexanoïque; 75mm imidazole, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gel de gradient: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Empilement de gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / 3 mix bisAA </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel de tampon 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> APS 10% </td><td> 139 ul </td><td> 125 pi </td><td></td><td> 67 ul </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 ul </td><td> 12,5 ul </td><td></td><td> 6,7 ul </td></tr></tbody></table> Anode tampon: 25mm imidazole / HCl, pH 7,0 Buffer Cathode: Tricine 50 mM, 7,5 mm d&#39;imidazole / HCl, 0,02% p / v dodécyl-bD-maltoside, 0,05% p / v désoxycholate, pH 7,0 Verser et exécuter des gels dans une chambre froide (4-7 ° C). La tension initiale utilisée est de 100V. Lorsque l&#39;échantillon est entré dans le gel de concentration, la tension est élevée à 500V avec le courant limité à 15mA (pour 0,15 &#39;14&#39; 14 cm gels). L&#39;électrophorèse est arrêté après 3-4 h quand la ligne forte de colorant du rouge Ponceau S se rapproche de la première gel. Alternativement, un gel peut être exécuté pendant la nuit avec une tension constante à 70-100V. <ol><li> Tests d&#39;activité dans le gel. Le temps d&#39;incubation pour chaque dosage dépend de l&#39;efficacité de la solubilisation des protéines et la quantité de matière chargée par puits. Complexes I, IV et V donnent habituellement des signaux plus forts que des complexes II et III. </li></ol> Complexe I (CI) Incuber la tranche de gel avec CI tampon (Tris-HCl 5 mM, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) à température ambiante pendant plusieurs heures. CI mémoire tampon: Ajouter de 5 mm par 100 ml de Tris-HCl, pH 7,4: 0,01 g NADH 0.25g NBT Fixer le gel dans du méthanol à 50% et 10% d&#39;acide acétique pour les 15-45 min. Le gel fixe est conservé dans l&#39;acide acétique à 10%. Complexe II (CII) Incuber la tranche de gel avec des CII tampon (20 mM de sodium succinate; methasulfate phénazine 0.2mm; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) à température ambiante pendant plusieurs heures. CII mémoire tampon: Ajouter de 5 mm par 100 ml de Tris-HCl, pH 7,4: 200 pl de succinate de sodium 1M Methasulfate phénazine 80μl (PMS 250mm dissous dans du DMSO) 0.25g NBT Fixer le gel comme décrit pour le complexe I Complexe III (CIII) Incuber la tranche de gel avec CIII tampon (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2, de 0,05% de 3,3 &#39;-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB)) à température ambiante pendant plusieurs heures. CIII tampon: Ajouter par 100 ml de phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2: Tétrachlorhydrate diaminobenzidine 50mg Fixer le gel comme décrit pour le complexe I Complexe IV (CIV) Incuber la tranche de gel avec CIV tampon (phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2, de 0,05% de 3,3 &#39;-diaminobenzidine tétrachlorhydrate (DAB), 50 microns cheval de coeur du cytochrome c) à température ambiante pendant plusieurs heures. CIV tampon: Ajouter par 100 ml de phosphate de sodium 50 mM, pH 7,2: Tétrachlorhydrate diaminobenzidine 50mg 0.1g cheval de coeur du cytochrome c Fixer le gel comme décrit pour le complexe I Complexe V (CV) Incuber la tranche de gel avec CV de tampon (Tris-35mm de base, 270mm de glycine, pH 8,3 à 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% p / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) à température ambiante pendant plusieurs heures. CV de tampon: 100ml de solution par ajouter: <table border="0"><tbody><tr><td> Base Tris </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Pas besoin d&#39;ajuster le pH (qui devrait être 8.3) - ne pas utiliser d&#39;acide ou de base. Filtrez et ajoutez <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Fixer le gel dans du méthanol à 50% pendant 30 minutes et le transfert à l&#39;eau.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous avons décrit l&#39;extraction des complexes de protéines mitochondriales de cellules souches embryonnaires humaines, leur séparation par électrophorèse haute résolution claire gel natif (hrCNE), et l&#39;analyse subséquente par en gel des essais d&#39;activité catalytique. hrCNE résout mitochondriale des complexes protéine membranaire à une résolution comparable à celle de l&#39;électrophorèse sur gel bleu natif et est supérieure pour les tests d&#39;activité dans le gel. Cette technique peut être employée non seuleme...

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>ajuster le pH à 8,0 avec du NaOH</td></tr><tr><td>NaCl 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Succinate de sodium 1 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 et BP329-1</td><td>Mélanger 68,4 ml de Na2HPO4 1 M et 31,6 ml de NaH2PO4 1 M pour préparer un tampon de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,2 à 25 °C</td></tr><tr><td>Tricine 1 M, pH 7,0 (ajusté avec NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>conserver à 4 °C</td></tr><tr><td>Imidazole/HCl 1 M, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>conserver à 4 °C</td></tr><tr><td>Tris-HCl 1 M, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Dodécyl-β-D-maltoside (DDM) 20 % (poids/volume)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Dissous dans l’eau. Conserver des aliquotes de 1 ml à &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Digitonine 10 % (poids/volume) (&amp;gt;50 % de pureté, utilisée sans recristallisation)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Dissous dans l’eau. Conserver des aliquotes de 0,1&amp;#8211;1 ml à &amp;#8211;20 °C. Doit être chauffé à 95 °C avant utilisation.</td></tr><tr><td>Acide 6-aminohexanoïque 2 M</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>conserver à 4 °C</td></tr><tr><td>Solution mère de Ponceau S/glycérol 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 et G6279-1L</td><td>Ponceau S 0,1 %, glycérol 50 % (poids/volume) dans l’eau.</td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium 10 % p/v</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Dissous dans l’eau. Doit être protégé de la lumière. Ajuster le pH à 7,0 avec du HCl, filtrer et conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Phénazine méthasulfate (PMS) 250 mM</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Dissous dans le DMSO et aliquoté. Conserver à &amp;#8211;20 °C.</td></tr><tr><td>Nitro-bleu de tétrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tétrahydrochlorure (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&amp;rsquo;-triphosphate disodique (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Grade I, minimum 99 %</td></tr><tr><td>Bêta-nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), forme réduite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c provenant du cœur de cheval</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéases 100x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Conserver à &amp;#8211; 20 °C.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Colorant bleu de trypan 0,4 %</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine 10x (0,5 %)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Les mitochondries sont des organites cytoplasmiques qui ont un rôle primordial dans le métabolisme cellulaire et l&#39;homéostasie, la régulation du réseau de signalisation cellulaire, et la mort cellulaire programmée. Les mitochondries produisent l&#39;ATP, de réglementer l&#39;état redox cytoplasmique et Ca2 + bilan, cataboliser acides gras, de synthétiser l&#39;hème, nucléotides, hormones stéroïdes, acides aminés, et aider à assembler fer-soufre dans les protéines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans la production de chaleur. Les mutations du génome mitochondrial entraîner plusieurs types de trouble humain. L&#39;accumulation de mutations de l&#39;ADNmt est en corrélation avec le vieillissement et est soupçonné d&#39;avoir un rôle important dans le développement du cancer. En raison de leur rôle d&#39;une importance vitale dans tous les types de cellules, la fonction des mitochondries doit aussi être critique pour les cellules souches. Avancées majeures ont été faites dans notre compréhension de la viabilité des cellules souches, la prolifération, et la capacité de différenciation. Mais l&#39;activité fonctionnelle des cellules souches, en particulier de leur état énergétique, ne fut pas encore été étudiés en détail. Presque rien n&#39;est connu sur les propriétés des mitochondries des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et leur descendance différenciée précurseur. Une façon de comprendre et d&#39;évaluer le rôle des mitochondries dans la fonction de CSEh et le potentiel de développement est de mesurer directement l&#39;activité des complexes respiratoires mitochondriaux. Ici, nous décrivons haute résolution électrophorèse sur gel natif claires et les suivants dans la visualisation de l&#39;activité de gel comme une méthode pour analyser les cinq complexes de la chaîne respiratoire des CSEh.

Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysées à l&#39;aide des tests d&#39;activité de gel.

Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Les mitochondries sont des organites cytoplasmiques qui jouent un rôle primordial dans le métabolisme et l'homéostasie cellulaires, la régulation du réseau de signalisation cellulaire, et...

Les mitochondries jouent de nombreux rôles dans la physiologie cellulaire, allant du métabolisme et de la production d'énergie à la mort cellulaire programmée et à la synthèse des hormones stéroïdiennes. Malgré l'importance des mitochondries dans les fonctions cellulaires fondamentales ainsi que dans les maladies, très peu de choses sont connues sur la fonction mitochondriale dans les cellules souches embryonnaires humaines et leurs descendants différenciés. Dans cette vidéo, nous vous montrerons comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches embryonnaires humaines peuvent être analysés à l'aide de dosages d'activité en gel.Bonjour, je suis Ivan OV du laboratoire de Michael Tetel, Département d'anatomie et de médecine de laboratoire à l'Université de Californie à Los Angeles. Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure permettant d'évaluer la fonction des complexes respiratoires mitochondriaux dans les cellules souches embryonnaires humaines. Cette évaluation de l'activité in gel consiste à isoler un pellet mitochondrial brut à partir de cellules souches embryonnaires humaines, à séparer les complexes mitochondriaux du système de phosphorylation oxydative par électrophorèse native sur gel de polyacrylamide à haute résolution, puis à réaliser une détection in gel de l'activité enzymatique.Commençons. La première étape de cette procédure consiste à isoler les mitochondries à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Pour ce dosage, nous utiliserons des cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur une plaque recouverte de matrigel, dans des conditions sans cellules nourricières.Pour recueillir des mitochondries à partir de nos cellules souches humaines, nous commençons par les laver avec du PBSDX à 1x, à 37 °C et de pH 7,4, puis nous soumettons les cellules à une action de la trypsine pendant cinq minutes. Vous pouvez utiliser un millilitre de trypsine 1x par puits dans une plaque de six puits. Après cinq minutes, vous pouvez arrêter la réaction en ajoutant un volume égal d'inhibiteur de trypsine frais (1 milligramme par millilitre) dans du PBS 1x, puis récolter les cellules.Les cellules recueillies sont ensuite centrifugées à 200 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et resuspendez les cellules en culot dans 0,8 à 1,7 millilitre de tampon d'isolement de mitochondries glacé contenant un cocktail fraîchement préparé d'inhibiteurs de protéases à 1×. La quantité de tampon utilisée dépend de la taille du culot cellulaire obtenu. Une fois le culot resuspendu, incubez-le sur de la glace pendant environ 10 minutes.Après l'incubation, nous lysons les cellules à l'aide d'un homogénéisateur, ce qui peut nécessiter environ 40 à 50 mouvements. Nous pouvons vérifier l'achèvement complet de l'homogénéisation en colorant un aliquot des cellules DOD au bleu de trypan et en les examinant au microscope optique. Le résultat devrait ressembler à ceci.Ceci est la première prise après 50 coups avec un downs. Ceci est la deuxième prise après 80 coups avec un downs. Une fois les cellules homogénéisées, centrifuger à 20 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés C. Cela nous donnera un culot mitochondrial brut, qui contiendra également des noyaux et des fragments cellulaires plus gros.Avant la collecte du culot, il faut peser le tube de collecte afin d'estimer le poids du culot ultérieur, verser et éliminer le surnageant, puis peser le culot brut de mitochondries précipité. En soustrayant le poids du tube à ce stade, on peut passer à la solubilisation du culot, ce qui sera montré à l'étape suivante. Pour solubiliser le culot mitochondrial brut, on commence par maintenir le culot sur glace et par vortexer avec 35 microlitres de tampon de solubilisation glacé.Pour chaque 20 milligrammes de culot, des informations détaillées sur les composés tampons sont indiquées dans le protocole écrit joint. Après vortexage et ajout du tampon de solubilisation, et avant d'ajouter la digitonine, nous transférons le culot resuspendu dans un tube adapté à une centrifugation à haute vitesse, puis nous ajoutons 20 microlitres de digitonine à 10 % poids/volume pour 20 milligrammes de masse de culot, et nous mélangeons en tapotant le tube. Après un mélange complet, nous incubons le culot mitochondrial pendant cinq à dix minutes sur de la glace. Le Doil bêta D multiside ou le DDM ou le Triton X-100 peuvent être utilisés en remplacement de la digitonine pour solubiliser les protéines.Le choix du détergent et de sa quantité peut influencer la formation de supercomplexes ou de formes multimériques des complexes mitochondriaux après l'incubation sur glace. Une fois que le culot a été solubilisé, nous le centrifugeons à cent mille fois g pendant 15 minutes à quatre degrés C, puis nous récupérons le surnageant clair. Nous sommes maintenant prêts à préparer le surnageant pour son dépôt sur notre gel en gradient destiné à l'électrophorèse native en gradient de gels des mitochondries.Nous recommandons d'utiliser un gel de gradient d'acrylamide allant de 5 à 13 % avec un gel de concentration de 3,5 %. Pour préparer le gel, nous utiliserons un mélange d'acrylamide-bisacrylamide tel que décrit dans le protocole écrit. La solution d'acrylamide-bisacrylamide est préparée à l'avance et conservée à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière.L'acrylamide et la bis-acrylamide sont des produits chimiques toxiques, tant sous forme de poudre que sous forme liquide, il convient donc d'être particulièrement prudent lorsqu'on les manipule. Nous combinons la solution d'acrylamide-bis-acrylamide avec un aliquot d'un tampon gel trois fois composé d'acide 1,6-hexanediamino à 1,5 molaire et de 75 millimolaire d'oléate à un pH de 7,0. La quantité de solution d'acrylamide-bis-acrylamide que nous ajoutons au tampon dépendra du pourcentage de gel que nous préparons pour réaliser le gel en gradient.Nous préparerons un mélange à 4 % et un mélange à 13 %, et le gel de concentration sera un mélange à 3,5 %. N'oubliez pas d'ajouter du glycérol au mélange à 13 %. Lorsque les trois mélanges sont prêts, nous ajoutons une quantité appropriée de persulfate d'ammonium et de TEMED aux mélanges, puis nous les versons dans la chambre de coulée d'un formateur de gradient.La partie gauche de la chambre contient le mélange à 5 %. La partie droite de la chambre contient le mélange à 13 % avec une petite barre magnétique d'agitation. Nous commençons à verser le gel en ouvrant la partie droite de la chambre.Ensuite, nous ouvrons immédiatement la partie gauche de la chambre et laissons la solution à 5 % se mélanger à une solution à 13 % afin de former le gradient. Nous ajoutons une petite quantité d'isopropanol au sommet du gel pour obtenir une frontière nette et droite après la polymérisation. Environ une heure plus tard, lorsque la polymérisation du gel gradient est terminée, nous retirons l'isopropanol et ajoutons le gel de concentration à 3,5 % dans l'appareil, puis insérons un peigne à gel.Nous assemblerons et ferons fonctionner les gels dans une chambre froide d’environ quatre à sept degrés Celsius. Pour faire fonctionner ce gel, nous utiliserons deux tampons différents. Dans la chambre de l’anode, nous utiliserons un tampon contenant de l’acide chlorhydrique à 25 millimolaire, pH 7,0.Le tampon cathodique contiendra 50 millimètres tric, 7,5 millimolaire olé hydrochlorure, 0,02 % poids par volume, doïl bêta D multiside ou DDM et 0,05 % poids par volume, désoxy coate pH 7,0. Afin de préparer le surnageant à déposer sur le gel que nous venons de couler, on ajoute un tampon de charge pour obtenir une concentration finale de 5 % poids par volume de glycérol et de 0,01 % poids par volume. Ponto S, nous ajoutons généralement une solution mère 10 x contenant du glycérol et du poncho s directement aux surnageants.Nous sommes maintenant prêts à charger l'échantillon sur le gel. Nous chargerons les puits du gel avec un volume contenant de 20 à 40 milligrammes de protéines mitochondriales brutes par lane. Immédiatement après le chargement, le gel est électrophoré à 100 volts.Une fois que l'échantillon est entré dans le gel de concentration, la tension peut être augmentée à 500 volts, le courant étant limité à 15 milliampères. Bien que nous ayons l'habitude de faire migrer le gel toute la nuit à une tension de 70 à 100 volts, nous arrêtons l'électrophorèse lorsque une ligne nette du colorant rouge zos approche du front du gel. Maintenant que le gel a été parcouru, nous pouvons analyser l'activité des différents complexes protéiques directement dans le gel.La durée d'incubation pour chaque test dépend de l'efficacité de la solubilisation des protéines et de la quantité de matériau chargée par puits. Les complexes un, quatre et cinq produisent généralement des signaux plus intenses que les complexes deux et trois. C'est pourquoi le temps de coloration pour les complexes deux et trois doit être plus long.Pour tester l'activité du complexe, nous devrons utiliser des tampons spécifiques pour chaque complexe. Vous trouverez les ingrédients des tampons individuels dans le protocole écrit. Nous allons maintenant découper les bandes individuelles du gel afin de réaliser séparément les tests d'activité en gel.Pour tous les complexes, incuber le morceau de gel dans leurs tampons respectifs plusieurs heures à température ambiante, pour tous les complexes sauf le complexe cinq. Après l'incubation, fixer le gel dans 50 % méthanol et 10 % acide acétique pendant 15 à 45 minutes. Le gel fixé est conservé dans 10 % acide acétique.Vous voyez ici à quoi ressemble la coloration du complexe I. On observe une bande d'un violet foncé dans la tranche de gel, correspondant au complexe I. Les gels transparents permettent d'effectuer une densitométrie des activités des complexes mitochondriaux et de réaliser des analyses comparatives.Après la cytométrie dense, nous séchons généralement les tranches de gel pour un stockage à long terme et/ou pour une numérisation afin d'obtenir une image de haute qualité. Deux complexes présentent la même couleur violette, tandis que le complexe trois et le complexe quatre donnent tous deux une bande colorée en orange ou jaunâtre. Voici des exemples d'activités de coloration des complexes deux, trois et quatre.Nous venons de vous montrer comment analyser l'activité des complexes d'exsudation mitochondriaux, extraits de cellules souches embryonnaires humaines et séparés par une résolution plus élevée, y compris l'électrophorèse sur gel natif. Voilà donc tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.

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