Palpage pour activité complexe mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines

Les mitochondries ont de nombreux rôles dans la physiologie cellulaire, du métabolisme et de la production d’énergie à la mort cellulaire programmée en passant par la synthèse des hormones stéroïdes. Malgré l’importance des mitochondries dans les fonctions cellulaires fondamentales et les maladies, on sait très peu de choses sur la fonction des mitochondries dans les cellules souches embryonnaires humaines et leur descendance différenciée. Dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules souches humaines peuvent être analysés à l’aide de dosages d’activité Ingel.

Bonjour, je suis Ivan OV du laboratoire de Michael Tetel au Département de pathologie et de médecine de laboratoire de l’Université de Californie à Los Angeles. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’évaluation de la fonction du complexe respiratoire mitochondrial dans les cellules souches embryonnaires humaines. Ces dans l’activité du gel évaluent cette procédure implique l’isolement du palais mitochondrial brut des cellules souches embryonnaires humaines, la séparation des complexes mitochondriaux du système de phosphorylation exsudative avec une électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif clair à plus haute résolution, et ultérieure dans l’activité du gel sa.

Alors commençons. La première étape de cette procédure consiste à isoler les mitochondries des cellules souches embryonnaires humaines. Pour ce test, nous utiliserons des cellules souches embryonnaires humaines qui ont été cultivées sur une plaque recouverte de matrigel dans une condition sans mangeoire.

Afin de collecter des mitochondries de nos cellules souches humaines, nous commençons par les laver avec une XPDS pH 7,4 chaude, puis nous essayons les cellules pendant cinq minutes. Vous pouvez utiliser un mil d’un x trypsine par puits dans une plaque à six puits. Après cinq minutes, vous pouvez arrêter la réaction en ajoutant un volume égal d’inhibiteur de trypsine frais d’un milligramme par mil dans un XPBS et récolter les cellules.

Les cellules collectées sont ensuite centrifugées à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’essorage, jetez le surnageant et le réusus, suspendez les cellules granulées dans 0,8 à 1,7 millilitres de tampon d’isolement des mitochondries glacé avec un cocktail fraîchement préparé d’un inhibiteur de protéase x. La quantité de tampon que vous utilisez dépend de la taille de la pastille de cellule que vous obtenez Une fois la pastille remise en suspension, incubez-la sur de la glace pendant environ 10 minutes.

Après l’incubation, nous descendons les cellules avec un homogénéisateur, cela peut prendre environ 40 à 50 coups. Nous pouvons vérifier la liste complète de l’homogénéisation en colorant une aliquote des cellules DOD avec du bleu trian et en regardant au microscope optique. Cela devrait ressembler à ceci.

Il s’agit du premier coup après 50 coups avec un downs. Il s’agit du deuxième coup après 80 coups avec un downs. Une fois les cellules homogénéisées, centrifugez-les à 20 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés C.Cela nous donnera une pastille mitochondriale brute, qui contiendra également des noyaux et des fragments cellulaires plus gros.

Avant de collecter le granulé, nous devons peser le tube de collecte afin d’estimer le poids ultérieur du granulé, verser et jeter le surnageant, puis peser le boulet mitochondrial brut précipité. En soustrayant le poids du tube à ce stade, on peut procéder à la solubilisation de la pastille, ce qui sera montré à l’étape suivante. Afin de solubiliser la pastille mitochondriale brute, nous commençons par maintenir la pastille sur de la glace et la vortex avec 35 microlitres de tampon de solubilisation à froid glacé.

Pour chaque 20 milligrammes de granulés dont nous disposons, des informations détaillées sur les composés tampons sont mentionnées dans le protocole écrit qui l’accompagne. Après le vortex et l’ajout d’un tampon de solubilisation et avant d’ajouter le doigt toin, nous transférons le granule en suspension dans un tube approprié pour la centrifugation à grande vitesse, puis nous ajoutons 20 microlitres de 10 % de poids par volume pour 20 milligrammes de poids de granulé et mélangeons en effleurant le tube après qu’il ait été soigneusement mélangé, incubons le granule mitochondrial pendant cinq à 10 minutes sur de la glace. Doil beta D multiside ou DDM ou Triton X 100 peut être substitué à digit toin pour obtenir des protéines solubilisées.

Le choix du détergent et sa quantité peuvent affecter la formation de supracomplexes ou de formes multimériques de complexes mitochondriaux après l’incubation sur glace. Et une fois que la pastille a été solubilisée, nous la centrifugerons à cent mille fois G pendant 15 minutes à quatre degrés C, puis nous récupérerons le surnageant clair. Nous sommes maintenant prêts à préparer le surnageant pour fonctionner sur notre gel de gradient pour l’électrophorèse native sur gel de gradient des mitochondries.

Nous recommandons d’utiliser un gel dégradé d’acrylamide de 5 à 13 % avec un gel empilable de 3,5 %. Pour préparer le gel, nous utiliserons un mélange d’acrylamide bis acrylamide tel que décrit dans le protocole écrit. La solution d’acrylamide bis acrylamide est préparée à l’avance et stockée à quatre degrés Celsius dans un endroit sombre.

L’acrylamide et l’acrylamide sont des produits chimiques toxiques à la fois sous forme de poudre et de liquide, une attention particulière doit donc être portée lorsque vous travaillez avec eux. Nous combinons la solution d’acrylamide bis acrylamide avec une aliquote de trois tampons de gel composée de 1,5 molaire d’acide aminoïque et de 75 millimolaires à pH 7,0. La quantité de solution d’acrylamide bis acrylamide que nous ajoutons au tampon dépendra du pourcentage de gel que nous fabriquons pour fabriquer le gel de gradient.

Nous ferons un mélange de 4 % et un mélange de 13 %, et le gel d’empilement sera un mélange de 3,5 %. N’oubliez pas d’ajouter du glycérol au mélange à 13 %. Lorsque les trois mélanges sont prêts, nous ajoutons une quantité appropriée d’ammonium par sulfate et par témide aux mélanges et versons les mélanges dans une chambre de coulée à gradient

La partie gauche de la chambre contient les 5 % de mixage. La partie droite de la chambre contient les 13 % de mélange dans une petite barre d’agitation magnétique. Nous commençons à verser le gel en ouvrant la partie droite de la chambre.

Ensuite, immédiatement, nous ouvrons la partie gauche de la chambre et laissons la solution à 5 % se mélanger avec une solution à 13 % pour former le gradient. Nous ajoutons une petite quantité d’isopropanol sur le dessus du gel pour former une bordure droite et nette pour le gel après polymérisation. Environ une heure plus tard, lorsque la polymérisation du gel de gradient est terminée, nous retirons l’isopropanol et versons le gel d’empilage 3,5 dans l’appareil et insérons un peigne de gel.

Nous allons assembler et faire fonctionner les gels dans une chambre froide d’environ quatre à sept degrés Celsius. Pour exécuter ce gel, nous allons utiliser deux tampons différents. Dans la chambre d’anode, nous utiliserons un tampon contenant 25 millimolaires d’acide chlorhydrique oléole pH 7,0.

Le tampon cathodique contiendra 50 millimètres d’acide chlorhydrique, 7,5 millimolaires d’acide chlorhydrique, 0,02 % en poids par volume, doil beta D multiside ou DDM et 0,05 % en poids par volume, deoxy coate pH 7,0. Afin de préparer le surnageant à analyser dans le gel que nous venons de verser, un tampon de chargement est ajouté pour obtenir une concentration finale de 5 % en poids par rapport au volume de glycérol et de 0,01 % en poids par rapport au volume. Ponto S, nous ajoutons généralement une solution mère de 10 x contenant du glycérol et des ponchos directement aux surnageants.

Nous sommes maintenant prêts à charger l’échantillon de gel sur le gel. Nous chargerons les puits de gel d’un volume contenant 20 à 40 milligrammes de protéine mitochondriale brute par voie. Immédiatement après le chargement, le gel fonctionne à 100 volts.

Une fois que l’échantillon est entré dans le gel d’empilement, la tension peut être augmentée à 500 volts avec un courant limité à 15 milliampères. Bien que nous fassions généralement fonctionner le gel pendant la nuit à 70 à 100 volts, nous arrêtons l’électrophorèse lorsqu’une ligne nette du colorant rouge zos s’approche du front du gel. Maintenant que le gel a été exécuté, nous pouvons analyser l’activité de différents complexes protéiques directement dans le gel.

Le temps d’incubation de chaque essai dépend de l’efficacité de la solubilisation des protéines et de la quantité de matériau chargée par puits. Les complexes un, quatre et cinq produisent généralement des signaux plus forts que les complexes deux et trois. C’est pourquoi le temps de coloration pour les complexes deux et trois doit être plus long.

Pour tester l’activité complexe, nous devrons utiliser des tampons spécifiques pour chaque complexe. Vous trouverez les ingrédients des différents tampons dans le protocole écrit. Maintenant, nous allons découper des voies individuelles du gel pour effectuer les dosages d’activité Ingel séparément.

Pour tous les complexes, incubez la tranche de gel dans leurs tampons respectifs pendant plusieurs heures à température ambiante pour tous les complexes sauf le complexe cinq. Après l’incubation, fixez le gel dans du méthanol à 50 % et de l’acide acétique à 10 % pendant 15 à 45 minutes. Le gel fixé est conservé dans de l’acide acétique à 10 %.

Vous voyez ici comment apparaît la coloration d’un complexe. Il y a une bande violette foncée dans la tranche de gel qui correspond à une bande complexe. Les gels transparents vous permettent d’effectuer une densitométrie à partir d’activités complexes mitochondriales et de faire des analyses comparatives.

Après une cytométrie dense, nous séchons généralement les tranches de gel pour un stockage à long terme et/ou pour un balayage afin d’obtenir un complexe d’image de haute qualité, deux colorants de la même couleur violette qu’un complexe trois et complexe quatre. Les deux donnent une bande de coloration orange ou jaunâtre. Voici des exemples d’activités complexes de coloration, trois, trois et quatre.

Nous venons de vous montrer comment analyser l’activité des complexes d’exsudation mitochondriale, qui ont été extraits de cellules souches embryonnaires humaines et séparés par une résolution plus élevée, y compris les électros de gel natifs. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.