Générer des cellules iPS de MEFS travers l'expression forcée de Sox-2, Oct-4, c-Myc et Klf4

Il y a plus de 50 ans, on a émis l’hypothèse que les cellules différenciées en phase terminale, telles que les fibroblastes cutanés, pouvaient être forcées de prendre un état pluripotent similaire aux cellules souches embryonnaires. La base de ce concept était l’observation que tous les types de cellules, à quelques exceptions près, ont le même code génétique et que la seule différence entre les types de cellules est la façon dont le code est lu. Cette capacité à changer l’identité cellulaire d’une cellule différenciée en un état pluripotent est appelée reprogrammation cellulaire.

Après une demi-décennie de recherche, il a récemment été démontré que l’expression forcée de quatre facteurs de transcription peut reprogrammer les fibroblastes cutanés pour qu’ils deviennent pluripotents. L’impact de cette constatation est énorme. Au-delà de l’importance pour la biologie fondamentale, il permet également de surmonter les principales objections éthiques à l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines pour la thérapie de transplantation.

Pour que la reprogrammation se produise, quatre gènes codant pour les facteurs de transcription OC quatre, sox deux, cmic et K 4, doivent être emballés et placés dans une culture de tissu lentivirus. Un milieu contenant un virus purifié est ensuite ajouté à une boîte de culture cellulaire contenant une forte densité de fibroblastes, et à l’intérieur de cette boîte, quelque chose d’étonnant se produit. Une petite fraction des fibroblastes est infectée par les quatre facteurs de transcription porteurs de virus et commence à se dédifférencier.

Ils subissent des changements drastiques dans leur morphologie et leur prolifération et commencent à se diviser en grands amas spirituels de cellules souches pluripotentes formées. Après deux à trois semaines de culture dans des conditions de cellules souches embryonnaires, les colonies de fibroblastes reprogrammés peuvent être isolées manuellement et développées in vitro. Une fois purifiées, ces cellules peuvent être utilisées pour générer des souris chimériques chez lesquelles un certain pourcentage de cellules dérivent de ces fibroblastes dédifférenciés peuvent contribuer à différents tissus de la souris.

Dans les carillons dans lesquels le matériel génétique des fibroblastes d’origine a contribué à la lignée germinale, le code génétique est transmis à la génération suivante, puis à la suivante, puis à la suivante. Bien que l’utilisation d’un système d’administration virale soit actuellement un obstacle aux applications cliniques, ce problème sera probablement surmonté à court terme. Dans cette vidéo, les membres du laboratoire yin démontreront comment les cellules souches puissantes induites sont dérivées de fibroblastes embryonnaires de souris.

Bonjour, je m’appelle Grant Welted et je travaille dans le laboratoire de Rudolph Jish au Whitehead Institute for Biomedical Research à Cambridge, dans le Massachusetts. Et je suis Tobias Bro brink, également de ish lab. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la génération de cellules souches pluripotentes induites par l’introduction de quatre CDNA : OCT, quatre SOX, deux CIC, KF quatre, en utilisant des lentivirus qui expriment ces quatre CDNA à partir d’un promoteur de TET OCMV.

Cela permet un contrôle précis de l’expression de ces quatre transgènes après l’infection de fibroblastes embryonnaires de souris. Le protocole que nous vous montrons aujourd’hui implique la manipulation de lentivirus qui peuvent éventuellement infecter les cellules humaines. Il est essentiel que vous suiviez toujours les procédures de sécurité et que vous contactiez votre bureau de la sécurité avant d’essayer de le faire vous-même.

Générons donc quelques cellules IPS afin de générer un lentivirus qui convertira mes cellules en cellules IPS. 2 9 3 cellules doivent être transfectées avec trois plasmides Paks deux, qui fournissent les éléments génétiques nécessaires à l’emballage viral. Le squelette viral, qui est un lentivirus FUW TE OCMV avec l’un des quatre CD aide T quatre SOX deux, KLA quatre ou CMIC PMDG, qui exprime la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire ou VSV.

Cela fait le virus qui va générer un virus atropique. Il faut donc suivre les procédures appropriées de BL deux plus. Dans cette vidéo particulière, nous ne manipulons pas réellement le virus infectieux, donc nous ne portons pas nos blouses habituelles et ne sommes pas dans notre établissement BL two plus.

Avant la transfection 2, 9 à 3 cellules sont décongelées à partir d’azote liquide et cultivées jusqu’à une fluidité à 90 % Co. Les cellules sont ensuite transfectées avec le gène FU et administrées 48 à 72 heures pour exprimer le virus, après quoi le milieu baignant les cellules est filtré à l’aide d’un filtre de 0,45 micron et concentré par ultracentrifugation après avoir concentré le virus. Nous sommes maintenant prêts à infecter le MES afin de générer des clusters IPS Au cours des étapes de préparation virale, les fibroblastes embryonnaires de souris passent moins de trois fois sont cultivés jusqu’à 90 % de fluidité dans des boîtes de 10 centimètres, environ deux fois 10 à six cellules par boîte. Dans ce protocole expérimental particulier, nous utilisons des MES qui expriment le RTTA, qui est essentiel pour l’expression de la doxycycline et de la GFP à partir du locus OC quatre endogène.

Les cellules MES sont négatives à la GFP, mais les vraies cellules IPS deviennent positives à la GFP. Ce marqueur permet une méthode par laquelle identifier les mès reprogrammés, aspirer le milieu de culture des fibroblastes et laver avec 10 mils de hippies, EDTA, jeter les hippies EDTA et ajouter cinq mils d’une fois trypsine et incuber à 37 degrés pendant 10 minutes. La trypsine aidera à soulever les cellules du fond des boîtes.

Ajoutez maintenant neuf mils du milieu de culture pour remettre les cellules en suspension dans une suspension unicellulaire et transférez-les dans un tube de 15 mil. Ces cellules sont ensuite filées et granulées. Après la suspension de la pastille, le nombre de cellules dans la suspension est compté et la concentration est ajustée à huit fois 10 à quatre cellules par mil.

10 mils de suspension cellulaire sont ensuite transférés dans une boîte de 10 centimètres recouverte de gélatine. Incuber la boîte pendant la nuit à 37 degrés Celsius 5 % CO2 après l’incubation pendant la nuit, le milieu d’une boîte de fibroblastes est aspiré et 10 mils du milieu contenant le virus sont ajoutés à la méthamphétamine. Incuber les cellules de quatre heures à toute la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % CO2.

Le lendemain, aspirez le milieu d’une parabole de sablage, puis ajoutez 10 mils de média ESL frais. À ce stade, les cellules peuvent être congelées, élargies ou préparées pour le début de la reprogrammation. Pour initier la reprogrammation, remplacez le milieu ESL régulier par un milieu contenant de la doxycycline pour initier l’expression des quatre gènes.

Placez ces cellules dans l’incubateur, changez de milieu tous les jours jusqu’à ce que les colonies deviennent assez grandes pour être cueillies. Les colonies devraient d’abord devenir visibles environ une semaine après le début de la reprogrammation. Ils devraient devenir assez grands pour être ramassés vers le 20e jour.

Maintenant que 20 jours se sont écoulés, nous pouvons aller de l’avant et cueillir les colonies IPS avant de choisir les colonies. Il ne faut pas oublier de voir le nombre requis de plaques de gélatine enrobées de 24 puits avec DR irradié aux rayons gamma quatre mythes une à deux heures avant la cueillette. Il faut nourrir les colonies sur les plaques en ajoutant un milieu frais juste avant la cueillette, ajouter 50 microlitres de tampon HEPA aux puits d’un plat à fond en V de 96 puits immédiatement avant la cueillette, laver la boîte contenant les colonies à cueillir une fois avec du PBS et ajouter 10 ml de PBS dans la parabole. Les grappes de cellules IPS peuvent être sélectionnées sous un stéréomicroscope ou un microscope inversé.

Prélevez les colonies à l’aide d’une petite pointe de pipette et transférez-les dans un puits dans la boîte à 96 puits contenant du PBS afin de retirer les grappes. Un cercle est dessiné à l’aide d’une pointe de pipette autour de l’amas pour interrompre les mathématiques. Maintenant, les cellules reprogrammées peuvent être extraites à l’aide de la pipette multicanaux, 20 microlitres de tripsin sont ajoutés à chacune.

Eh bien, faites-le monter et descendre trois fois, incubez à 37 degrés C pendant quatre minutes. Après l’incubation de quatre minutes, 100 microlitres de milieu ES sont ajoutés aux belles colonies de tripps. Faites-le monter et descendre 10 fois et transférez six clones à la fois.

De la boîte à 96 puits à une boîte à 24 puits en utilisant une pointe à chaque autre position sur la pipette à 12 places, les cellules sont ensuite cultivées sur la plaque à 24 puits dans un incubateur à 37 cents, 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 à 90 % de fluidité Co ajustement de la charcuterie avec le milieu cellulaire ES les cellules seront probablement prêtes à se développer dans trois à sept jours Quelques jours plus tard. Maintenant que les cellules IPS sont confluentes, aspirez le milieu et lavez les cellules avec un mil de hippies Retirez complètement les hippies et ajoutez 100 microlitres de trypsine et incubez à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation avec de la trypsine, ajoutez 400 microlitres de milieu ESL et suspendez les cellules en pipetant de haut en bas et produisez une suspension unicellulaire.

La suspension de cellules uniques de 500 microlitres provenant des 24 puits est ensuite transférée dans un seul puits d’une plaque à six puits et incubée dans un incubateur à 37 degrés Celsius à 5 % de CO2 jusqu’à ce que les cellules atteignent une fluidité de 80 à 90 % de CO2 dans la plaque à six puits. À ce stade, vous pouvez soit procéder à l’amplification des cellules pour l’analyse sudiste, les blastes, les injections, les tests de tératome ou les tests de différenciation in vitro. Et vous devez vous rappeler de congeler les vannes de stock de ces cellules afin de ne pas perdre ce précieux stock de cellules IPS.

Nous venons de vous montrer comment induire la pluripotence dans un fibroblaste embryonnaire de souris à l’aide d’un système antiviral inductible. Alors merci d’avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.