Name: Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Découvrez l'isolation et l'analyse des cellules souches hématopoïétiques du placenta chez la souris. Cette méthode permet de visualiser les niches microenvironnementales uniques et d'étudier la biologie des cellules souches.

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1. Retrait de l&#39;embryon et du placenta de dissection <ol><li> Pour commencer, les embryons doivent d&#39;abord être isolés à partir des barrages enceinte. </li><li> Les animaux sont euthanasiés selon les procédures approuvées - dans notre cas nous allons utiliser une dose létale de l&#39;isoflurane anesthésie </li><li> Tout d&#39;abord, le ventre de pulvérisation avec de l&#39;éthanol et de faire une petite incision avec une paire de ciseaux. </li><li> Arrachez la peau avec les deux mains pour découvrir l&#39;abdomen et à ciel ouvert le péritoine. </li><li> Avec des pinces, ramasser les cornes utérines et de recueillir leur aide de ciseaux à chaque extrémité distale. Placez les cornes utérines dans une boîte de Pétri remplie de PBS et placer sur la glace. Aussi, n&#39;oubliez pas de laver plusieurs fois avec du PBS avant d&#39;isoler le placenta. Nous pouvons maintenant isoler le placenta. </li><li> Avec deux pinces, commencent attentivement retirant le tissu de l&#39;endomètre entourant le conceptus embryon. Il faut être prudent à ne pas percer ou autrement infliger des dommages structurels à des embryons, car cela compliquerait les étapes ultérieures de dissection. </li><li> Placez le conceptus isolés dans un nouveau plat de pétri avec du PBS sur la glace et continuer jusqu&#39;à ce que tous conceptus ont été libérés de l&#39;endomètre. </li><li> Transfert d&#39;une conceptus un nouveau plat de pétri avec du PBS placé sous le microscope et avec deux pinces éplucher les decidua loin de la barrière placentaire. Enlevez autant de la caduque que possible que les cellules decidua va interférer avec une seule cellule de suspension et de cytométrie en flux. Un mouvement continu lisse peeling est recommandé de réaliser les meilleurs résultats. </li><li> Couper le sac vitellin loin de le placenta à la jonction entre les deux organes et tirez doucement le sac vitellin et les vaisseaux vitellins loin de la barrière placentaire. Il faut prendre soin de ne pas perturber la plaque choriale du placenta, surtout avec des embryons précoces. </li><li> Soigneusement tenant la plaque choriale du placenta avec une paire de pinces et le cordon ombilical avec un autre, tirez le cordon ombilical et de l&#39;embryon attachée loin de la barrière placentaire. </li><li> Retirer l&#39;excès de tissu à cellules géantes sur les bords du placenta afin de minimiser les cellules agglutination pendant la préparation de la suspension à cellule unique. </li><li> Recueillir le placenta dans un récipient approprié, tel qu&#39;un tube de 15 ml Falcon, avec PBS% FCS et 5 sur la glace. Faites cela pour tous les placentas disséqués. </li><li> À ce stade, vous pouvez soit procéder à la préparation d&#39;une suspension à cellule unique pour la cytométrie de flux, des tests fonctionnels, tels que la culture in vitro ou la transplantation, ou de préparer le placenta entier pour la fixation des tissus et fixes bloc congelé intégration éventuelle pour l&#39;immunohistochimie. </li></ol> 2. Préparation de unicellulaire suspension de tissu placentaire <ol><li> Nous allons maintenant vous montrer comment générer une suspension cellulaire unique à partir de placenta pour analyse FACS. </li><li> Pour préparer une suspension cellulaire unique du placenta, la mécanique et de la dissociation enzymatique est nécessaire. D&#39;abord préparer une solution de collagénase 0,1% dans PBS avec 10% de SVF et 1% d&#39;une solution de pénicilline / streptomycine. </li><li> Ajouter un volume approprié de solution de collagénase à l&#39;placentas, selon le nombre que vous avez. Un volume qui est le double du volume du placenta, et entre 2-5ml est recommandée. </li><li> Utilisez une aiguille 16 G monté sur une seringue de 5 ml mécaniquement à détruire le tissu par passage de la solution de collagénase et de placenta par l&#39;aiguille 3 fois. Répétez l&#39;opération avec une aiguille 18-G. </li><li> Placer l&#39;échantillon dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur pendant 45 minutes. </li><li> Après l&#39;incubation de 45 minutes dans de la collagénase, le passage de la solution de la cellule grâce à une aiguille 20 G, et incuber pendant 45 minutes supplémentaires, à 37 ° C. </li><li> Après les heures d&#39;incubation 1,5 total dans la collagénase, le passage de la solution par le biais de cellules de 22 G et 25 G-aiguilles 3 fois avec chaque aiguille. </li><li> Filtrer l&#39;échantillon à travers un filtre de 50 um à un nouveau 15 ml de tube Falcon, laver avec du PBS 5% SVF et centrifuger à 4 ° C pendant 5 minutes à 300 x g. </li><li> À ce stade, nous avons une suspension cellulaire unique adapté à l&#39;analyse FACS ou des tests fonctionnels. </li></ol> 3. Fixation des tissus pour les coupes congelées <ol><li> Immédiatement après avoir isolé le placenta de chaque embryon, elles sont placées dans du PBS 1X froid. Habituellement une plaque de 96 puits qui fonctionne le mieux pour les placentas jeunes (E8.5-11.5), mais avec plus de placentas, E12.5 et plus, une plaque de 24 puits peut être plus pratique. </li><li> Chaque placenta est transféré dans un nouveau puits rempli de 4% fraîchement dégelé paraformaldahyde ou PFA. Pour la E12.5 placentas, le tissu est déplacé vers un nouveau puits à la main, mais pour le E10.5 vous pouvez retirer le CPE soigneusement avec une pipette et ajoutez les PFA. Il est important que le placenta est complètement immergé pendant 2-4 heures à 4 ° C, selon l&#39;âge et la taille des tissus. </li><li> Transférer le tissu dans 30% de sucrose, ou si les tissus sont très petits et fragiles, aspirer la PFA et ajouter du saccharose directement. A ce stade, les placentas seront flottants en solution. Laissez les tissus nuit à 4 ° C.</li><li> Après l&#39;étape de nuit dans 30% de sucrose, les tissus devrait finalement couler au fond du puits, indicatif de cryoconservation approprié. Retirer la moitié de la solution de saccharose et de remplacer le volume avec les PTOM et placer le tissu de retour à 4 ° C pendant 1-2 heures. Cela facilite la pénétration octobre </li><li> Transfert le tissu à 100% pour octobre 1 heure, après quoi il peut être incorporé. </li></ol> 4. Intégrer le tissu fixe <ol><li> Moules étiquette en plastique avec une identification appropriée des tissus (par exemple la moisissure spectacle). </li><li> Tirez le tissu de la solution PTOM et coupé le placenta dans la moitié en orientant le placenta en forme de disque avec le côté du cordon ombilical vers le bas et soigneusement couper avec une lame de rasoir propre en veillant à déplacer la lame avant et en arrière avant de relâcher la pression pour assurer une même coupe. Le placenta est coupé en deux pour obtenir le meilleur prientation au plus tard, de visualiser les CSH placentaires. </li><li> Moitié du placenta Placer un au fond du moule avec le bord coupé en contact avec la surface du fond du moule. Répétez l&#39;opération avec un nouveau moule pour l&#39;autre moitié. Pour E10.5 placentas, les deux moitiés peuvent être placés dans le même moule en utilisant la même technique. </li><li> Lors du coulage PTOM dans le moule, il peut être difficile de garder le placenta dans le bon sens. Fixez le placenta en place par la tenue de la moitié des tissus avec une pince. Verser lentement la solution PTOM dans le moule et éviter de produire des bulles. Pour E10.5 placentas, maintenez la moitié des tissus par des pinces et le repos de la moitié des autres tissus contre l&#39;extérieur de la pince. Verser lentement la solution PTOM décrit pour E12.5 placentas. </li><li> Une fois le moule est rempli avec des PTOM, de placer rapidement le moule sur la glace sèche, les PTOM se tourneront flash blanc geler le tissu </li><li> Placer le moule dans un petit sac en plastique contenant Drierite et immédiatement dans le magasin de congélateur à -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole permettra à l&#39;isolement et la visualisation des tissus placentaires et souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices. Pour un résumé complet sur le rendement attendu et cellulaires nombre de CSH dans le placenta et les autres organes hématopoïétiques fœtales à travers le développement du fœtus nous nous référons à Gekas, et al. 2005. Pour la localisation des CSH en développement et d&#39;autres cellules hématopoïétiques dans le placenta nous nous référons à Rhodes, et al....

Liste de Matériaux: Le glucose 100 mM 10 mM NaN3 15 ml conique tubes (BD) 16-G, 18 G, 20 G, 22-G et 25 G-aiguilles (BD) 30% Solution Sucrée 35mm boîtes de Pétri (BD) Paraformaldéhyde à 4% 50 - Filtres de cellules m (Celltrics) Seringues de 5 ml (BD) Phosphatase alcaline Substrat Kit I (Vector Rouge, Vector) Phosphatase alcaline Substrat Kit III (Blue Vector, Vector) Antibiotiques (pénicilline / streptomycine, P / S) solution de Collagénase de type I (Sigma) Cryomold moules jetables Spécimen de vinyle (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Cytokératine anticorps primaire (DakoCytomation) Pinces à dissection, acier inoxydable ou en titane, numéro 5 ou 55 Drierite Sérum fœtal bovin (FBS) Fisherbrand plastique Microscope Glissez Mailer (Fisher) 1000u/ml glucose oxydase Lévamisole (Vector) Montage des médias, à base aqueuse milieu de montage (VectamountTM AQ) Sérum de cheval normal (Vector) Température de coupe optimale (PTOM, Tissue-Tek) Substrat Peroxydase DAB Kit (Vector) Tampon phosphate salin (PBS) avec du calcium / magnésium (Ca 2 + w / Mg 2 +) Tampon phosphate salin (PBS) sans calcium / magnésium (w / o Ca2 + / Mg2 +) Slide Box plastique (détient 100 diapositives) Tubes en plastique (PVC Nalgene 180 autoclavable non toxique) Tube en polypropylène de test à fond rond, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Protéinase K 20mg/ml Solution (Amresco) Produits de recherche International Corp super Pap Pen HT marqueurs * Slide (2,5 mm, Fisher) Culture tissulaire traitée en U (à fond rond) des plaques de 96 puits ou 24 puits (Falcon BD) Tween 20, SigmaUltra (Sigma) Kit d&#39;amplification tyramide (Invitrogen) Vectastain ABC phosphatase alcaline standard Kit (Vector) Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)

isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la capacité de s&#39;auto-renouveler et de générer tous les types de cellules des lignées de sang à travers la vie d&#39;un individu. Tous les CSH apparaissent pendant le développement embryonnaire, après quoi leurs dimensions de la piscine est maintenue par l&#39;auto-renouvellement des divisions cellulaires. Identifier l&#39;origine anatomique des CSH et les événements critiques de développement régulation du processus de développement HSC a été compliqué car beaucoup de sites anatomiques participer durant l&#39;hématopoïèse fœtale. Récemment, nous avons identifié le placenta comme un organe majeur où les CSH hématopoïétiques sont générées et élargi dans des niches uniques microenvironnementales (Gekas, et al 2005, à Rhodes, et al 2008). En conséquence, le placenta est une source importante de CSH au cours de leur émergence et l&#39;expansion initiale. Dans cet article, nous montrons les techniques de dissection pour l&#39;isolement du placenta de souris E10.5 E12.5 et embryons, ce qui correspond aux étapes de développement de l&#39;initiation des CSH et le pic de la taille de la piscine HSC dans le placenta, respectivement. En outre, nous présentons un protocole optimisé pour la dissociation enzymatique et mécanique du tissu placentaire dans une seule cellule de suspension pour une utilisation en cytométrie en flux ou des tests fonctionnels. Nous avons constaté que l&#39;utilisation de la collagénase pour une seule cellule de suspension du placenta donne des rendements suffisants de CSH. Un facteur important affectant le rendement HSC du placenta est le degré de dissociation mécanique avant, et la durée de traitement enzymatique. Nous fournissons également un protocole pour la préparation de surgelés fixe des coupes de tissus placentaires pour la visualisation de développer CSH par immunohistochimie dans leurs niches précises cellulaire. Comme hématopoïétiques antigènes spécifiques ne sont pas conservés lors de la préparation des sections paraffine, nous utilisent couramment fixes coupes congelées pour localiser les CSH et les progéniteurs placentaire.

Nous avons identifié le placenta comme un organe majeur lors du développement hématopoïétique. Nous avons constaté que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à la fois générées et développées dans le placenta dans des niches uniques microenvironnementales. Ici, nous décrivons des techniques expérimentales nécessaires à l&#39;isolement et la visualisation des CSH dans le placenta de souris.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la capacité de s'auto-renouveler et de générer tous les types cellulaires des lignées sanguines tout au long de la vie d'un individu. ...

Bonjour, je suis Mikkola et bienvenue dans mon laboratoire. Le principal objectif de notre laboratoire est d'étudier le développement des cellules souches hématopoïétiques. Lors de l'embryogenèse, nous avons identifié le placenta comme un organe hématopoïétique majeur et découvert que les cellules souches hématopoïétiques sont à la fois générées et amplifiées dans le placenta, au sein de niches microenvironnementales uniques.À ce titre, le placenta présente une valeur considérable comme source de cellules souches hématopoïétiques lors de leur émergence et de leur expansion initiale. Aujourd'hui, les membres de mon laboratoire présenteront les techniques expérimentales nécessaires pour isoler les cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta et visualiser les CSH dans leurs niches microenvironnementales uniques. Bonjour, je suis Chriss Geka du laboratoire de la Dre Hannah Mola, du Département de biologie cellulaire moléculaire et développementale de l'UCLA.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment disséquer le placenta de souris et préparer une suspension de cellules uniques à partir du tissu placentaire pour une analyse FACS des cellules souches hématopoïétiques fœtales. Je suis Katrina Rhodes, et je vais vous montrer comment préparer le tissu placentaire pour l'immunohistochimie. Commençons donc.Pour commencer, les embryons doivent d'abord être isolés de femelles gestantes. Les animaux sont euthanasiés selon des procédures approuvées. Dans notre cas, nous allons utiliser une dose létale de l'anesthésique isoflurane.Tout d'abord, vaporisez de l'éthanol sur le ventre et pratiquez une petite incision à l'aide d'une paire de ciseaux. Écartez la peau à deux mains pour découvrir l'abdomen, puis ouvrez le péritoine à l'aide d'une pince. Saisissez les cornes utérines et prélevez-les à l'aide de ciseaux à chaque extrémité distale.Placer les cornes utérines dans une boîte de Pétri remplie de PBS et mettre sur de la glace. Pensez également à laver plusieurs fois avec du PBS avant d'isoler le placenta à l’aide de deux pincettes. Commencez à détacher soigneusement le tissu endométrial entourant les embryons.Ces embryons proviennent du jour embryonnaire 12,5, correspondant à l'âge de développement où les cellules souches hématopoïétiques, ou HSC, atteignent leur pic dans le placenta. Il faut veiller à ne pas percer ni endommager structurellement les embryons, car cela compliquerait les étapes ultérieures de dissection. Placer les embryons isolés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS sur de la glace et poursuivre jusqu'à ce que tous les embryons aient été libérés de l'endomètre.Transférez un conceptus dans la nouvelle boîte de Pétri contenant du PBS placée sous le microscope. À l’aide de deux pincettes, détachez l’ectoderme du placenta G. Éliminez autant que possible l’ectoderme, car les cellules ectodermiques risquent d’interférer.Avec une suspension de cellules uniques et la cytométrie en flux. Un mouvement de pelage lisse et continu est recommandé pour obtenir les meilleurs résultats. À noter que, lorsqu'on travaille avec des embryons plus jeunes comme ces embryons au jour embryonnaire 10,5 ou E 10,5, le deidra entoure tout le conceptus.Contrairement aux embryons E 12,5, chez les embryons E 10,5 les CSH commencent tout juste à émerger au sein du placenta. Remarquez la différence de taille considérable entre les embryons E 10,5 et E 12,5. Détachez la vésicule vitelline du placenta au niveau de la jonction entre les deux organes, puis retirez délicatement la vésicule vitelline et les vaisseaux allantoïdes du placenta.Il convient de faire attention à ne pas perturber la plaque choriale du placenta, en particulier chez les embryons précoces. Tenir soigneusement la plaque choriale du placenta avec une pince tout en maintenant le cordon ombilical avec une autre pince. Séparer délicatement le cordon ombilical et l'embryon attaché du placenta.Retirer les excès de tissu à cellules géantes situés aux bords du placenta afin de minimiser l'agglutination cellulaire lors de la préparation d'une suspension cellulaire unique. Placer le placenta dans un récipient approprié, tel qu'un tube Falcon de 15 mL contenant du PBS et 5 % de FCS, puis le mettre sur de la glace. Procéder de la même manière pour tous les placentas disséqués. À ce stade, il est possible soit de poursuivre par la préparation d'une suspension cellulaire unique destinée à des essais fonctionnels en cytométrie en flux, tels que la culture in vitro ou la transplantation, soit de préparer le placenta entier pour la fixation tissulaire et l'inclusion en bloc congelé fixé, en vue d'une immunohistochimie ultérieure.Nous allons maintenant vous montrer comment générer une suspension de cellules uniques à partir du placenta pour une analyse par fax. Préparez d'abord une solution de collagénase à 0,1 % dans du PBS contenant 10 % de FCS et une solution de pénicilline-streptomycine à 1 %. Ajoutez un volume approprié de solution de collagénase au placenta selon la quantité que vous avez ; un volume équivalent à deux à cinq millilitres, soit environ deux fois le volume du placenta, est recommandé.Utilisez une aiguille de calibre 16 fixée à une seringue de cinq ml pour rompre mécaniquement les tissus en faisant passer la solution de collagénase et le placenta à travers l'aiguille trois fois. Répétez l'opération avec une aiguille de calibre 8. Placez l'échantillon dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 45 minutes après une incubation de 45 minutes.Lors du passage à la collagénase, faire passer la solution cellulaire à travers une aiguille de calibre 20 et incuber pendant 45 minutes supplémentaires à 37 degrés après l'incubation totale d'une heure et demie. Lors du passage à la collagénase, faire passer la solution cellulaire à travers des aiguilles de calibre 22 et de calibre 25, trois fois avec chaque aiguille. Filtrer ensuite l'échantillon à travers un filtre de 50 micromètres fixé à un nouveau tube Falcon de 15 mL, laver avec du PBS contenant 5 % de FCS et centrifuger à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes à 300 ×g. À ce stade, nous obtenons une suspension monocellulaire adaptée à l'analyse par cytométrie en flux.Je vais vous montrer comment préparer un tissu placentaire pour l'immunohistochimie. L'immunohistochimie du tissu placentaire peut être utilisée pour localiser les cellules souches hématopoïétiques au sein du microenvironnement placentaire. Immédiatement après l'isolement du placenta à partir de chaque embryon, ceux-ci sont placés dans du PBS 1X froid ; généralement, une plaque de 96 puits convient mieux pour les placentas jeunes, du jour embryonnaire 8,5 à 11,5, mais avec des placentas plus âgés (E 12,5 et plus), une plaque de 24 puits peut être plus pratique.Chaque placenta est transféré dans un nouveau puits rempli de PARALDÉHYDE à 4 % ou de PFA fraîchement décongelé pour le placenta du jour E 12,5. Le tissu est déplacé manuellement vers un nouveau puits. Mais pour le placenta du jour E 10,5, vous pouvez retirer soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette et ajouter le PFA.Il est important que le placenta soit complètement immergé pendant deux à quatre heures à quatre degrés C, selon l'âge et la taille du tissu. Ensuite, transférer le tissu dans du saccharose à 30 %. Ou, si les tissus sont très petits et fragiles, aspirer le PFA et ajouter directement le saccharose.À ce stade, le placenta flottera dans la solution. Laisser le tissu toute la nuit à quatre degrés C. Après l'étape de congélation lente dans du saccharose à 30 %, les tissus devraient finalement couler au fond du puits, ce qui indique une cryoconservation adéquate. Ensuite, retirer la moitié de la solution de saccharose et remplacer le volume par du OCT.Remettez le tissu à quatre degrés C pendant une à deux heures. Cela facilite la pénétration de l'OCT. Enfin, le tissu sera transféré dans de l'OCT à cent pour cent pendant une heure, après quoi il pourra être inclus.Étiqueter les moules en plastique avec l'identification appropriée du tissu. Sortir le tissu de la solution OCT et couper le placenta en deux en orientant le placenta de forme disque avec le côté du cordon ombilical vers le bas, puis en tranchant soigneusement avec la lame de rasoir propre, en veillant à déplacer la lame vers l'arrière. Et quatrièmement, avant de relâcher la pression, afin d'assurer une coupe régulière.Le placenta est coupé en deux pour obtenir la meilleure orientation en vue de la visualisation ultérieure des cellules souches hématopoïétiques placentaires. Ensuite, placer une moitié de placenta au fond du moule, avec le bord coupé en contact avec la surface inférieure du moule. Répéter l'opération avec un nouveau moule pour l'autre moitié.Pour les placentas E 10,5, les deux moitiés peuvent être placées dans le même moule en utilisant la même technique. Lors de la verse de l’OCT dans le moule, il peut être difficile de maintenir le placenta dans l’orientation correcte. Fixez le placenta en place en tenant la moitié du tissu avec une pince pour le placenta E 10,5.Tenez une moitié de tissu avec des pinces et appuyez l'autre moitié contre l'extérieur des pinces. Versez ensuite lentement la solution OCT comme décrit pour E 12,5. Une fois le moule rempli de solution OCT, placez rapidement le moule sur de la glace sèche.L'OCT deviendra blanc lors de la congélation rapide du tissu ; placez alors le moule dans un petit sac en plastique et stockez-le immédiatement dans un congélateur à moins 80 °C. Voici une coupe représentative d’un placenta à E 10,5. Il est important que vos coupes incluent la plaque choriale, visible au bas de l’image, ainsi que le labyrinthe placentaire, région du placenta qui permet les échanges fœto-maternels et qui est située au centre de l’image.Cette section a été colorée avec un anticorps anti-CD31, qui a marqué en rouge l'endothélium. Les trophoblastes, montrés en brun, sont marqués par la cytokeratine. Le labyrinthe contient à la fois des vaisseaux de la vascularisation fœtale marqués en rouge, ainsi que des espaces sanguins maternels bordés par les trophoblastes bruns.Les cellules bleues sont des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques naissantes positives pour le CD41, observez qu'elles se localisent dans la vascularisation fœtale. Nous venons de vous montrer comment disséquer et préparer une suspension unicellulaire de placenta de masse, ainsi que comment identifier les cellules souches hématopoïétiques placentaires par cytométrie en flux. Nous vous avons également montré comment préparer des coupes de tissu placentaire afin de visualiser les cellules souches hématopoïétiques par immunohistochimie.Il est important de prêter attention à quelques paramètres critiques lors de l'exécution de ces procédures. Lors de la dissection placentaire, il est essentiel de travailler rapidement et de maintenir les embryons et les solutions aussi fraîches que possible afin de préserver une viabilité cellulaire élevée pour la préparation de la suspension monocellulaire. Le degré de dissociation mécanique avant le traitement enzymatique ainsi que la durée d'incubation pendant ce traitement constituent les facteurs les plus critiques influant sur la viabilité et la santé cellulaire.Enfin, lors de l'immunohistochimie, une sur-fixation peut poser des problèmes pour certains antigènes, tandis qu'une sous-fixation peut entraîner la destruction du tissu. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Cette vidéo montre comment les micro-dissection du sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région à partir d'embryons et l'utilisation de cytométrie en flux à trier les cellules souches hématopoïétiques.

L&#39;isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

Une méthode pour analyser la distribution des progéniteurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse par cytométrie en flux ainsi que d'isoler efficacement hautement purifiées de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est décrite. La procédure d'isolement est essentiellement basée sur l'enrichissement magnétique des cellules + c-kit et de tri cellulaire pour purifier CSH pour des études cellulaires et moléculaires.

Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

Deux techniques pour isoler des gouttelettes lipidiques cellulaires à partir de 1) cellules de levure et 2) placentas humains sont présentés. L'élément central de ces deux procédés est centrifugation en gradient de densité, où la couche flottante résultant contenant les gouttelettes peuvent être facilement visualisés à l'oeil nu, on extrait et quantifié par analyse par transfert de Western pour la pureté.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

décrit ici un protocole pour isoler et approfondir l’étude des leucocytes infiltrants de la décidua basalis et de la decidua parietalis - l’interface mère-fœtus humaine. Ce protocole maintient l’intégrité des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, comme le prouve l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

décrit ici est un protocole permettant d’isoler et d’analyser les leucocytes infiltrants des tissus à l’interface mère-fœtus (utérus, décidua et placenta) des souris. Ce protocole maintient l’intégrité de la plupart des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, y compris l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

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Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

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Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Nous présentons un protocole étape par étape pour l’isolement des cellules souches hématopoïétiques à long terme (LT-HSC) et des CSH à court terme (ST-HSC) à l’aide du système rapporteur Hoxb5.

PROCÉDÉ D’ISOLEMENT DE CELLULES SOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES À LONG ET À COURT TERME

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