Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

La technologie de culture tissulaire a trouvé une large application dans le domaine de la biologie cellulaire. Cependant, les cellules cultivées nécessitent un entretien régulier pour rester en bonne santé. Lorsque les cellules atteignent la même fluidité, elles doivent être sous-cultivées ou passées.

Le non-respect de cette consigne entraîne une réduction de la croissance et, finalement, la mort cellulaire. Dans cette vidéo, nous montrons comment maintenir les cellules de culture tissulaire pour les lignées cellulaires adhérentes et en suspension. Bonjour, je m’appelle Ricky ici au laboratoire du Dr.LAN au Molecular Pathology Laboratories Network dans l’est du Tennessee.

Aujourd’hui, je veux vous montrer deux techniques d’emballage des cellules en suspension et des cellules adhérentes. Pour passer une plaque de Cells. Nous voudrons commencer par une culture primaire cultivée jusqu’à la même fluidité dans une boîte de Pétri de 60 millimètres ou un flacon de culture tissulaire de 25 centimètres carrés contenant cinq mils.

Nous commençons par retirer tout le milieu de la culture primaire à l’aide de la pipette stérile. Ensuite, nous lavons la monocouche cellulaire adhérente une ou deux fois avec un petit volume de 37 degrés Celsius HBSS sans calcium ni magnésium. Pour éliminer tout résidu de sérum fœtal bovin qui pourrait inhiber l’action de l’enzyme trypsine qui s’ajoutera à l’étape suivante.

Ensuite, ajoutez suffisamment de solution chaude de trypsine EDTA à la culture afin de couvrir la couche cellulaire adhérente. Ensuite, vous pouvez placer l’assiette sur un plateau chauffant à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Après l’incubation, tapotez le bas de la plaque sur une surface plane pour déloger les cellules.

Vérifiez la culture avec un microscope inversé pour vous assurer que les cellules sont arrondies vers le haut, ce qui indique qu’elles sont détachées de la surface. Si les cellules ne sont pas suffisamment détachées, remettez la plaque dans le plateau chauffant pendant une minute ou deux supplémentaires. Après avoir regardé à travers l’endoscope, rincez le plat dans un milieu complet et pipetez la suspension dans un tube conique de 15 mil contenant deux mils de milieu complet.

Faites tourner les cellules vers le bas pour les granuler et remettez le granulé en suspension dans un milieu complet. Maintenant, ajoutez un volume égal de suspension cellulaire à chacune des plaques fraîches qui ont été étiquetées de manière appropriée. Alternativement, les cellules peuvent être comptées à l’aide d’un hémocytomètre et diluées à la densité souhaitée afin qu’un nombre spécifique de cellules puisse être ajouté à chaque plaque.

Assurez-vous d’étiqueter chaque plaque avec la date de la sous-culture et le numéro de passage. Après avoir ajouté la suspension cellulaire, placez un mil de milieu frais à chaque nouvelle culture. Maintenant, incubez les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius 5 % de CO2.

Après avoir incubé les cellules pendant la nuit, ajoutez du milieu frais dans les plaques et remettez-les à 37 degrés. Une fois que la plaque a atteint la con fluence, vous pouvez passer à nouveau la plaque en répétant cette procédure et continuer à passer si nécessaire. Nous allons maintenant vous montrer comment faire passer des cellules en culture en suspension.

L’emballage des cellules en culture en suspension est plus simple que celui des cellules d’adhérence. Avant d’emballer les cultures en suspension, les cellules doivent être maintenues en les nourrissant tous les deux à trois jours jusqu’à ce qu’elles atteignent la co-fluidité, c’est-à-dire lorsque les cellules s’agglutinent dans la suspension et que le milieu apparaît turid. Lorsque le ballon est agité.

Pour ce faire, retirez le ballon des cellules en suspension de l’incubateur, en prenant soin de ne pas déranger celles qui se sont déposées dans le ballon. Fond aseptique, retirez et jetez environ un tiers du milieu du ballon et remplacez-le par un volume égal de milieu préchauffé à 37 degrés Celsius. Après avoir changé de milieu, faites tourner le ballon et remettez-le dans l’incubateur, qui est à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2.

S’il y a moins de 15 mils, un milieu dans le flacon incube le ballon en position horizontale pour améliorer le contact entre la cellule et le milieu. Sinon, le ballon peut être incubé verticalement les jours où les cultures ne sont pas nourries. Vérifiez-les en faisant tourner les plats pour remettre les cellules en suspension.

Assurez-vous d’observer tout changement de couleur dans le milieu qui indique une bonne croissance métabolique. Une fois que les cultures sont confluentes, ce qui devrait être d’environ 2,5 millions de cellules par mil, vous pouvez les faire passer. Une fois de plus, nous venons de vous montrer comment faire passer des cellules cultivées pour les cultures adhérentes et en suspension.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.