Trypsinisation et Repiquage des cellules de mammifères

La technologie de culture tissulaire a trouvé une large application dans le domaine de la biologie cellulaire. Toutefois, les cellules cultivées nécessitent un entretien régulier pour rester en bonne santé. Lorsque les cellules atteignent la confluence, elles doivent être resemées ou repiquées.

Le non-respect de cette consigne entraîne une croissance réduite et, à terme, la mort cellulaire. Dans cette vidéo, nous montrons comment maintenir en culture des cellules de lignées adhérentes et en suspension. Bonjour, je suis Ricky, ici au laboratoire du Dr. LAN, au sein du réseau des laboratoires de pathologie moléculaire du Tennessee oriental.

Aujourd'hui, je souhaite vous montrer deux techniques permettant d'isoler des cellules en suspension et des cellules adhérentes. Pour repiquer une culture de cellules, nous devons commencer par une culture primaire ayant atteint la confluence, cultivée dans une boîte de Pétri de 60 millimètres ou dans un flacon de culture tissulaire de 25 centimètres carrés contenant cinq millilitres de milieu de culture tissulaire.

Nous commençons par retirer tout le milieu de la culture primaire à l’aide d’une pipette stérile. Ensuite, nous lavons la monocouche de cellules adhérentes une ou deux fois avec un petit volume de HBSS à 37 degrés Celsius, sans calcium ni magnésium, afin d’éliminer tout sérum bovin fœtal résiduel qui pourrait inhiber l’action de l’enzyme trypsine que nous ajouterons à l’étape suivante.

Ensuite, ajoutez suffisamment de solution de trypsine-EDTA tiède à la culture pour recouvrir la couche de cellules adhérentes. Puis, placez la plaque sur un plateau chauffant à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Après l'incubation, tapez délicatement le fond de la plaque sur une surface plane afin de détacher les cellules.

Examinez la culture au microscope inversé pour vous assurer que les cellules sont arrondies, ce qui indique qu'elles se sont détachées de la surface. Si les cellules ne sont pas suffisamment détachées, remettez la plaque sur le plateau chauffant pendant une à deux minutes supplémentaires. Après avoir observé au microscope, rincez la boîte avec du milieu complet et transférez la suspension à l’aide d’une pipette dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de milieu complet.

Faire centrifuger les cellules pour former un culot et resuspendre le culot dans un milieu complet. Ajouter ensuite un volume égal de suspension cellulaire à chacune des plaques fraîches préalablement étiquetées. Alternativement, les cellules peuvent être comptées à l’aide d’un hémocytomètre, puis diluées à la densité souhaitée afin d’ajouter un nombre précis de cellules à chaque plaque.

Veillez à étiqueter chaque plaque avec la date du sous-culture et le numéro de passage. Après avoir ajouté la suspension cellulaire, ajoutez un mil de milieu frais à chaque nouvelle culture. Incubez ensuite les plaques dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après avoir incubé les cellules pendant la nuit, ajoutez du milieu frais dans les plaques et replacez-les à 37 degrés. Une fois que la plaque a atteint la confluence, vous pouvez repiquer à nouveau la plaque en répétant cette procédure et continuer à repiquer selon les besoins. Nous allons maintenant vous montrer comment repiquer des cellules en culture en suspension.

La culture en suspension de cellules d'emballage est plus simple que celle des cellules adhérentes. Avant d'embaler des cultures en suspension, les cellules doivent être entretenues par des renouvellements de milieu tous les deux à trois jours jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence, moment où les cellules s'agglomèrent dans la suspension et où le milieu apparaît trouble. Lorsque le flacon est agité en tourbillonnant.

Pour ce faire, retirez le flacon contenant les cellules en suspension de l’incubateur en prenant soin de ne pas déranger celles qui se sont déposées au fond du flacon. De manière aseptique, retirez et jetez environ un tiers du milieu du flacon, puis remplacez-le par un volume équivalent de milieu préchauffé à 37 degrés Celsius. Après avoir changé le milieu, agitez doucement le flacon et remettez-le dans l’incubateur, réglé à 37 degrés Celsius et 5 % CO2.

S'il y a moins de 15 ml de milieu dans le flacon, incubez-le en position horizontale afin d'améliorer le contact entre les cellules et le milieu. Sinon, le flacon peut être incubé verticalement les jours où les cultures ne sont pas alimentées. Vérifiez-les en agitant doucement les flacons pour resuspendre les cellules.

Veillez à observer tout changement de couleur du milieu, qui indique une bonne croissance métabolique. Une fois les cultures confluentes, soit environ 2,5 millions de cellules par mil, vous pouvez les repiquer. Encore une fois, nous venons de vous montrer comment repiquer des cellules cultivées, tant pour les cultures adhérentes que pour les cultures en suspension.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.