Congélation, la décongélation, et les cellules d'emballage pour les transports
2 juillet 2008
Cellules de mammifères cultivées sont largement utilisés dans les études de biologie cellulaire. Cette vidéo décrit les compétences de base requises pour congeler et conserver les cellules et comment faire pour récupérer les stocks de surgelés.
Les cultures cellulaires sont utilisées dans une grande variété d'applications de recherche et de diagnostic. Il peut être parfois souhaitable de conserver des lignées cellulaires pour des travaux futurs afin de préserver les cellules, d'éviter la sénescence, de réduire le risque de contamination et de minimiser les effets de la dérive génétique. Les lignées cellulaires peuvent être congelées pour une conservation à long terme.
Dans cette vidéo, nous vous montrons comment congeler des cellules cultivées en monocouche ainsi qu'en suspension, et comment les décongeler afin de les faire repousser. Bonjour, je suis Ricky, du laboratoire du Dr. LAN au sein du réseau des laboratoires de pathologie moléculaire du Tennessee oriental. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment congeler des cellules pour un stockage à long terme et comment les décongeler à partir de l'azote liquide.
Pour congeler des cellules adhérentes humaines, commencez par les détacher de la plaque comme vous le feriez lors d'une mise en culture. Gardez à l'esprit qu'il est préférable d'utiliser des cellules en phase logarithmique de croissance pour la cryoconservation. Une fois les cellules détachées et la réaction de trypsine arrêtée par l'ajout de sérum ou de milieu contenant du sérum, transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile pour centrifugeuse et ajoutez deux millilitres.
Des cellules issues de trois plaques ou plus provenant de la même sous-culture de la même source peuvent être combinées dans un seul tube avec du milieu complet contenant du sérum. Centrifuger les cellules pendant cinq minutes à 300 à 350 Gs à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mils à quatre degrés Celsius.
Milieu complet, ajouter un volume égal de milieu de congélation à quatre degrés, mélanger soigneusement les cellules, puis placer le tube sur de la glace et dénombrer les cellules. À l’aide d’un cytomètre sanguin, diluer la suspension avec davantage de milieu de congélation afin d’obtenir une concentration finale de 1 million ou 10 millions de cellules par millilitre. Pour congeler les cellules provenant d’un flacon carré de 25 centimètres carrés presque confluent, resuspendre dans environ trois millilitres de milieu de congélation. Prélever à la pipette un millilitre de la suspension cellulaire et le déposer dans des cryotubes de deux millilitres préalablement étiquetés.
Veillez à bien serrer les bouchons des vials. Placez les vials une heure à toute la nuit dans un congélateur à -80, puis transférez-les dans un congélateur de stockage à azote liquide. La congélation de cellules en culture en suspension suit un principe similaire à celui de la congélation de cellules issues d'une monocouche.
La principale différence est que les cultures en suspension n'ont pas besoin d'être d'abord tryps. Inisées ; transférez la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse et centrifugez pendant 10 minutes à 300 à 350 Gs à température ambiante. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez le culot dans du milieu de congélation à quatre degrés, à une densité de 1 million à 10 millions de cellules par millilitre.
Ensuite, transférez des aliquots de un millilitre de la suspension cellulaire dans des cryotubes et congélez-les. Comme cela a été fait pour les cultures en monocouche, qui ont été démontrées dans le chapitre précédent pour décongeler et récupérer les cryotubes congelés. Retirez d'abord le cryotube contenant les cellules du congélateur à azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain d'eau à 37 degrés.
Agiter continuellement le flacon jusqu'à ce que le milieu soit décongelé, ce qui prend généralement moins de 60 secondes. Une fois décongelé, essuyer le dessus du flacon avec de l'éthanol à 70 % avant de l'ouvrir. Ensuite, transférer la suspension de cellules décongelées dans un tube stérile de centrifugeuse contenant deux millilitres de milieu complet chaud et 20 % de sérum de veau fœtal, puis centrifuger.
Cette étape pendant 10 minutes à 150 à 200 Gs à température ambiante. Cette étape permet d'éliminer tout DMSO résiduel après la centrifugation ; jeter le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire dans une petite quantité d'environ un millilitre de milieu complet contenant 20 % de FBS, puis transférer cette suspension dans une plaque de culture correctement étiquetée contenant la quantité appropriée de milieu. Généralement, un millilitre de suspension cellulaire est nécessaire pour cinq à vingt millilitres de milieu.
Vous pouvez maintenant placer les cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour les faire croître après 24 heures. Vous devrez vous assurer que les cellules se sont bien fixées à la plaque après cinq à sept jours, ou lorsque l'indicateur de pH dans le milieu change de couleur, auquel cas vous devrez renouveler le milieu. Vous devrez maintenir les cultures dans un milieu contenant 20 % de FBS jusqu'à ce que la lignée cellulaire soit réétablie.
Si le taux de récupération est extrêmement faible, seule une sous-population de la culture initiale pourrait être en croissance. Soyez particulièrement vigilant à ce phénomène lorsque vous travaillez avec des lignées cellulaires connues pour être mosaiques. Si des cultures doivent être expédiées, cela peut être réalisé facilement tant pour les cultures en monocouche que pour les cultures en suspension.
Dans des flacons de culture de tissus de 25 centimètres, les cellules sont cultivées jusqu'à une confluence quasi complète en monocouche ou jusqu'à la densité souhaitée en suspension. Pour les cultures en monocouche, le milieu est d'abord éliminé, puis le flacon est rempli de milieu frais. Il est essentiel que le flacon soit complètement rempli de milieu afin d'empêcher les cellules de se dessécher si les flacons sont retournés pendant le transport.
Pour la suspension, du milieu frais est ajouté afin de remplir le flacon. Le bouchon est serré et fixé à l'aide de parafilm. Le flacon est scellé dans un sac en plastique étanche ou tout autre récipient étanche conçu pour éviter les déversements.
Dans le cas où le flacon serait endommagé, le contenant primaire est alors placé dans un contenant secondaire isolé afin de le protéger des températures extrêmes pendant le transport. Une étiquette de danger pour l'acheteur est apposée à l'extérieur de l'emballage. Généralement, les cultures sont transportées en service express la même nuit ou en une nuit par des coursiers.
Nous venons de vous montrer comment congeler et décongeler des cultures cellulaires humaines, tant pour les cellules adhérentes que pour les cellules en suspension. Voilà, c'est terminé. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans toutes vos expériences.
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Aperçu
Ce vidéo montre les techniques essentielles pour congeler et conserver des cellules de mammifères cultivées, ainsi que pour les récupérer à partir de stocks congelés. Un bon stockage des cellules est crucial pour préserver les lignées cellulaires destinées à des recherches futures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Techniques de culture cellulaire
- Conservation des cellules
Contexte
- Les cellules de mammifères cultivées sont largement utilisées dans la recherche.
- La congélation des cellules permet d'éviter la sénescence et la contamination.
- Le stockage à long terme des lignées cellulaires est essentiel pour les expériences futures.
- Des techniques de décongélation sont nécessaires pour réactiver les cellules congelées.
Objectif de l'étude
- Démontrer le processus de congélation des cellules pour un stockage à long terme.
- Expliquer comment décongeler des cellules congelées en vue d'une croissance ultérieure.
- Offrir des compétences pratiques aux chercheurs travaillant avec des cultures cellulaires.
Méthodes utilisées
- Congélation de cellules cultivées en monocouche et en suspension.
- Utilisation de l'azote liquide pour le stockage à long terme.
- Procédures de décongélation pour la récupération des cellules congelées.
- Démonstration des techniques en milieu de laboratoire.
Résultats principaux
- Consevation réussie de cellules de mammifères par congélation et stockage.
- Techniques de décongélation efficaces démontrées.
- Préservation de la viabilité cellulaire après décongélation.
- Conseils pour éviter les pièges courants liés au stockage des cellules.
Conclusions
- Les techniques de congélation et de décongélation sont essentielles pour les travaux de culture cellulaire.
- Des méthodes adéquates peuvent améliorer la longévité des lignées cellulaires.
- Ces compétences sont fondamentales pour les chercheurs en biologie cellulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La préservation fiable des cellules et leur récupération sont fondamentales pour maintenir des modèles précliniques cohérents et assurer la reproductibilité dans les validations ciblées et les flux de travail de développement de tests. Une cryoconservation adéquate minimise la dérive génétique et les risques de contamination, préservant ainsi l'intégrité à long terme des lignées cellulaires pour la recherche translationnelle. Ces techniques permettent une production cellulaire standardisée et évolutive tout au long des phases de découverte et préclinique, réduisant la variabilité dans les études mécanistiques et les efforts d'identification de candidats thérapeutiques.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet la préservation de lignées cellulaires génétiquement stables pour une analyse cohérente de l'engagement ciblé et des voies biologiques.
- Valeur opérationnelle : Réduit la nécessité de passages fréquents, minimisant ainsi la dérive phénotypique et la variabilité expérimentale.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des stocks cellulaires renouvelables et à faible passage pour des criblages à haut débit reproductibles et une qualification d'essai.
- Valeur opérationnelle : Favorise la cohérence entre lots dans les essais cellulaires, améliorant la fiabilité des données au cours des campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Garantit la continuité des modèles cellulaires pertinents pour la maladie, de la découverte à la validation préclinique.
- Valeur opérationnelle : Facilite la distribution standardisée des cellules entre équipes et sites, soutenant ainsi la collaboration interfonctionnelle.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La cryoconservation des cellules s'intègre dans la continuité de la découverte en permettant un approvisionnement cellulaire fiable pour la validation de cibles, le développement de tests et les essais précliniques, assurant ainsi la cohérence des modèles à travers les différentes étapes.
- Biologie de la découverte : Soutient la validation d'hypothèses en fournissant des lignées cellulaires stables et bien caractérisées pour la validation de cibles et l'élucidation des voies biologiques.
- Criblage : Permet la préparation des tests grâce à des stocks cellulaires standardisés et exempts de contamination, adaptés à un criblage reproductible de composés.
- Analytique : Génère des entrées cellulaires quantifiables et reproductibles qui renforcent la fiabilité des mesures de réponse dose-dépendante et de viabilité.
- Recherche translationnelle : Préserve la fidélité du modèle du stade de découverte précoce jusqu'aux études précliniques, réduisant ainsi les risques biologiques lors du développement des candidats médicaments.
- Réutilisation interne : Met en place une capacité banalisée et centralisée de conservation cellulaire, standardisant l'approvisionnement en cellules à travers les projets et les régions géographiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive en minimisant la dérive génétique et en assurant une cohérence phénotypique dans les tests cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des protocoles standardisés de congélation, de décongélation et d'emballage.
- Valeur stratégique : Réduit le risque d'échec en phase avancée en garantissant des modèles précliniques fiables et des résultats biologiques constants.
- Impact sur le portefeuille : Permet une prise de décision ajustée au risque en fournissant des systèmes cellulaires fiables pour la validation des cibles et l'optimisation des candidats.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en technique aseptique et en manipulation des cryoprotecteurs pour maintenir la viabilité cellulaire.
- Dépend de l'accès à un équipement de congélation à taux contrôlé et à une infrastructure de stockage dans l'azote liquide.
- Exige des procédures opérationnelles normalisées au sein des équipes afin d'assurer des taux de récupération cellulaire constants.
- Implique l'adaptation du milieu de congélation et de la densité cellulaire en fonction du type cellulaire et des caractéristiques de croissance.
- Limité par la sensibilité des lignées cellulaires aux cryoprotecteurs et au stress induit par les cycles de congélation-décongélation, ce qui peut affecter l'efficacité de la récupération.
