Name: Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Apprenez à cultiver des cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse de souris. Cette méthode permet d'isoler, différencier et analyser ces cellules clés pour l'immunologie et le développement de vaccins.

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JB est soutenu par des bourses d&#39;études en sciences naturelles et en génie (CRSNG). Prise en charge de ce projet ont été fournis par les Instituts canadiens de recherche en santé, Grant RdP-67 066.

Ce protocole a été adapté de Lutz et al. 1 Récolte et traitement de la moelle osseuse <ol><li> Isolement du tibia et du fémur: Euthanasier la souris donneuse et pulvériser les jambes avec de l&#39;éthanol à 70%. Saisir la cheville premier fermement avec une pince émoussée et de commencer à couper la peau et la musculature sous-jacente pour exposer le tibia. Pour éviter d&#39;endommager l&#39;os, couper lentement et parallèlement au tibia, laissant intact le genou. Pour nettoyer le fémur, immobiliser l&#39;articulation du genou en saisissant avec une pince émoussée. Nettoyez la musculature avec une paire de ciseaux pointus et pinces courbes. Continuez vers le haut jusqu&#39;à la hanche est exposée et les ciseaux peut être placée entre la tête du fémur et l&#39;articulation de la hanche. Enlever les os en coupant entre les communes du fémur et de la hanche et le placer dans un tampon phosphate salin (PBS) sur la glace. </li><li> Prélèvement de moelle osseuse: Nettoyer la musculature restant de l&#39;os en utilisant des ciseaux et des pinces courbes. Coupez les épiphyses de chaque os et de localiser la cavité centrale. En utilisant une seringue de 10 ml chargé avec du PBS et une 25G0.5 &quot;aiguille, rincer la moelle osseuse dans un non-tissu boîte de Petri couché. </li><li> Traitement de la moelle osseuse: Utilisez l&#39;extrémité en caoutchouc du piston d&#39;une seringue 1mL de dissocier la moelle osseuse dans une suspension à cellule unique (utiliser un haut et en bas, ne pas gratter le mouvement). Recueillir la moelle osseuse dans un tube conique faucon, et rincer la moelle osseuse résiduelle avec du PBS. </li></ol> Culture de cellules dendritiques <ol><li> Resuspendre les cellules dans les médias et le nombre de DC DC précurseurs sur un hématimètre (figure 1). Vous verrez les cellules de tailles diverses, les précurseurs DC sont les plus importants et les plus brillants. Différentiellement compter que ces cellules. De deux fémurs et deux tibias d&#39;un C57Bl type sauvage / 6 de la souris (6-8 semaines), vous devriez vous attendre entre 25-40 x 10 6 précurseurs DC totale. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figure 1 </li><li> Cellules en culture à une densité de 2 x 10 précurseurs DC 5 / mL dans des milieux supplémentés avec DC 40 ng / mL recombinante GM-CSF murin. Cellules de la plaque chez les non-tissus enduits des boîtes de Pétri en polystyrène. </li></ol> Ajouter des médias (jour 3) Pour actualiser les médias, ajouter la moitié du volume total des milieux frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF. Remplacer un tiers des médias (jour 6) et la maturation Pour actualiser les médias, retirez soigneusement tiers du volume total des médias et de remplacer ce volume avec les médias DC frais complété avec 40 ng / ml de GM-CSF au jour 6 de la culture. Si désiré, les cellules dendritiques peuvent être stimulés à l&#39;aide à la maturation des cytokines ou des ligands du récepteur Toll-like. Dans la vidéo, les PED ont été mûri par la stimulation pendant la nuit avec 5 ng / mL CpG. Récolte des cellules dendritiques La culture DC est complète (figure 2). Les cellules seront à la fois en suspension et vaguement adhérer à la plaque. Cellules adhérées peut être enlevé en grattant le plat avec un grattoir culture de tissus et de rinçage avec du PBS. Le nombre total de cellules augmente 5-8 fois pendant la semaine de la culture et la période de différenciation, par conséquent, espérer récolter de 1 à 1,6 x 10 6 cellules / ml. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figure 2" width="407" height="358" /> Figure 2 Réactifs <ol><li> CC des médias <ol><li> RPMI-1640, complété par: </li><li> 10% sérum de veau fœtal </li><li> 100 UI / ml de pénicilline </li><li> 100 pg / mL de streptomycine </li><li> 1% de L-glutamine </li><li> 0,1% de 2-mercaptoéthanol </li><li> 1X non acides aminés essentiels </li><li> 1X pyruvate de sodium </li></ol></li><li> Recombinant GM-CSF murin <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, au New Jersey, aucun catalogue. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

PED sont utiles pour les études d&#39;innée et adaptative des interactions immunitaires, et peut être utilisé comme un vecteur vaccinal. Dans cette vidéo, nous avons démontré les étapes pour isoler la moelle osseuse et de différencier les cellules dendritiques myéloïdes in vitro. Après la période de culture, ces cellules peuvent être visualisés au microscope deux cellules comme adhérente, qui possèdent souvent des dendrites, et les cellules rondes non-adhérents. Les PED peuvent encore être manipulées pour la présentation des antigènes par d...

<table><tbody><tr><td>GM-CSF murin recombinant</td><td>Réactif</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myéloïde des cellules dendritiques (CD) sont fréquemment utilisés pour étudier les interactions entre innée et adaptative des mécanismes immunitaires et la réponse précoce à l&#39;infection. Parce que ce sont les antigènes les plus puissants des cellules présentatrices, les PED sont de plus en plus utilisé comme un vecteur de vaccin à l&#39;étude de l&#39;induction de l&#39;antigène des réponses immunitaires spécifiques. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure pour la récolte de tibias et les fémurs d&#39;une souris donneuse, le traitement de la moelle osseuse et de différenciation in vitro de PED. Les propriétés du changement PED après stimulation: les cellules dendritiques immatures sont des phagocytes puissants, alors que les PED matures sont capables de présentation des antigènes et l&#39;interaction avec les cellules CD4 + et CD8 +. Ce changement dans l&#39;activité fonctionnelle correspond à la régulation positive des marqueurs de surface cellulaire et la production de cytokines. De nombreux agents peuvent être utilisés pour les PED matures, y compris les cytokines et les ligands de récepteurs toll-like. Dans cette vidéo, nous démontrons comparaisons de cytométrie en flux de l&#39;expression de deux molécules de co-stimulation, CD86 et CD40, et la cytokine, l&#39;IL-12, suite à une stimulation pendant la nuit avec un traitement CpG ou une maquette. Après différenciation, les PED peut être manipulé pour être utilisé comme vecteur de vaccin ou de générer des antigènes spécifiques par des réponses immunitaires in vitro, pulsant en utilisant des peptides ou des protéines, ou transduites à l&#39;aide de vecteurs viraux recombinants.

Cette vidéo montre la procédure pour différencier les cellules dendritiques myéloïdes de la moelle osseuse de souris. Isolement du tibia et du fémur de souris, et le traitement de la moelle osseuse sont démontrés. Photos montrant la morphologie des cellules avant et après différenciation, et les chiffres illustrant phénotype cellulaire et la maturation de production d&#39;IL-12 suivantes à l&#39;aide CpG sont affichés.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Les cellules dendritiques (CD) myéloïdes sont fréquemment utilisées pour étudier les interactions entre les mécanismes immunitaires innés et adaptatifs ainsi que la réponse précoce à ...

Je m'appelle Jeanette Boudreaux, et aujourd'hui, je vais vous guider à travers les étapes de la culture de cellules dendritiques myéloïdes miroirs à partir de précurseurs de la moelle osseuse. La lignée des DC myéloïdes suscite un intérêt croissant pour l'étude des interactions entre immunité innée et adaptative, et est de plus en plus utilisée comme plateforme pour le développement de vaccins. Aujourd'hui, nous allons vous présenter les étapes permettant d'isoler les cellules précurseurs, de les mettre en culture et de les différencier en cellules dendritiques.Ensuite, je vais vous montrer une analyse par cytométrie en flux des cellules avant et après maturation. En présence du ligand du récepteur de type Toll, les cellules prolifèrent in vitro pendant la période de culture ; prévoyez donc une augmentation d'environ cinq à huit fois du nombre total de cellules par rapport aux précurseurs que vous avez semés au jour zéro. Les procédures que je vais vous présenter aujourd'hui seront démontrées sur un plan de laboratoire ouvert, mais afin de préserver la stérilité, je vous recommande d'effectuer vos cultures dans une cabine de sécurité biologique ou sous hotte à flux laminaire.Pour c

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Présentation de l'antigène dans les organes lymphoïdes secondaires par des cellules dendritiques est crucial pour l'initiation de la cellule T médiée réponse immunitaire adaptative. Ici nous démontrons la culture de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées de souris, l'activation et d'étiquetage pour les deux photons d'imagerie.

Génération de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées murin pour l&#39;utilisation dans l&#39;imagerie 2-photons

Cette vidéo décrit un protocole pour la génération de cellules dendritiques - des cellules présentatrices d’antigènes clés qui activent les cellules T - à partir de la moelle osseuse d’une souris adulte.

Génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse : une méthode pour générer des cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Cette vidéo présente un test in vitro pour générer des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) à partir de cellules progénitrices lymphoïdes communes (CLP). Lors de la co-culture de CLP purifiés avec des cellules nourricières irradiées par γ en présence d’un ligand tyrosine kinase-3 (FL) de type Fms, les CLP se différencient en pDC non adhérentes, dont la présence est confirmée par cytométrie en flux.

Génération in vitro de cellules dendritiques plasmacytoïdes à partir de progéniteurs lymphoïdes communs

Les cellules dendritiques immatures peuvent être différenciées sélectivement en cellules dendritiques tolérogènes ou matures pour réguler l’équilibre entre l’immunité et la tolérance. Ce travail présente un moyen de générer à partir de cellules dendritiques (moDC) dérivées de monocytes immatures, des moDC tolérogènes in vitro et matures qui diffèrent par leurs phénotypes métaboliques.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Les cellules de moelle osseuse cultivées avec le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF) génèrent une culture hétérogène contenant des macrophages et des cellules dendritiques (DC). Cette méthode met en évidence l’utilisation de la liaison au MHCII et à l’hyaluronane (HA) pour différencier les macrophages des CD dans la culture GM-CSF. Les macrophages de cette culture présentent de nombreuses similitudes avec les macrophages alvéolaires.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Ici, nous démontrons comment les monocytes sont isolés par séparation par billes magnétiques des cellules mononucléées du sang périphérique après centrifugation par gradient de densité du sang anticoagulé humain. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains sont différenciés en cellules dendritiques immatures et sont prêts pour des procédures expérimentales dans un cadre non clinique.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Nous présentons ici une méthode économique et efficace pour isoler et générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse de haute pureté à partir de souris après 7 jours de culture avec 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

Apprenez à cultiver des cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse de souris. Cette méthode permet d'isoler, différencier et analyser ces cellules clés pour l'immunologie et le développement de vaccins.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

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