Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer des tranches rétiniennes du salamandre tigre pour des enregistrements en configuration patch clamp. Tout d'abord, je vais préparer deux types de lames de microscope. Nous utilisons des lames munies d'un puits adhésif fixé dessus afin de pouvoir les utiliser comme chambres fluides.

Sur la première lame, je place deux bandes parallèles de graisse à vide. Je prends ensuite du papier filtre et je le découpe en morceaux rectangulaires à l’aide d’un scalpel. Je place ensuite un des morceaux sur les rails de graisse et je le presse bien contre la lame pour qu’il adhère correctement.

Je fais de même pour l'autre morceau. Le second type de lame comporte de petits blocs en caoutchouc collés dessus. Pour l'instant, j'ajoute simplement un peu de graisse à vide entre les blocs, et je place également un nouveau morceau de lame de rasoir dans le coupe-tissus.

Enfin, je prépare les outils dont j'aurai besoin pendant la dissection, à savoir deux paires de pinces, une paire de ciseaux et un outil pour retirer l'œil de la tête afin d'enregistrer les courants induits par la lumière. La dissection doit être réalisée sous lumière infrarouge, mais à des fins de démonstration, je vais maintenant travailler sous lumière ordinaire. J'enlève d'abord l'œil et le place sous le microscope sur un morceau de papier absorbant que j'ai humidifié avec une solution de Ringer glacée.

Je retire ensuite le tissu conjonctif excédentaire du globe oculaire afin de m'assurer qu'il ne nuira pas à l'œil. Je coupe toujours le long de la surface. Voici ce que vous voyez au microscope.

Ensuite, j'utilise une lame de rasoir pour pratiquer une petite incision dans la cornée. Pour ce faire, je maintiens l'œil fermement avec la pince tout en appuyant le bord de la lame de rasoir contre la cornée. Je saisis ensuite la cornée avec la pince tout en l'excisant à l'aide des ciseaux afin d'extraire le cristallin.

J'applique une légère pression sur les bords de la cupule oculaire afin d'accéder facilement au cristallin avec la pince. Ensuite, j'enlève l'iris. Je maintiens l'iris avec la pince tout en coupant le long de l'aurasératé jusqu'à ce qu'il ne reste que la cupule oculaire.

Je découpe ensuite le godet I en deux morceaux rectangulaires. Je le coupe d'abord en deux parties égales, puis j'ajuste les bords supérieur et inférieur. Je prends maintenant l'une des lamelles que j'ai préparées précédemment, je saisis un morceau de godet I et je le place, côté rétine vers le bas, sur le papier filtre.

Je soulève ensuite cette sclérotique afin que seule la rétine reste sur la lame. Après cela, j'ajoute rapidement notre solution en anneau dans la chambre. Répétons la procédure pour le deuxième fragment de rétine.

Mais cette fois, vous pouvez observer à travers le microscope tout en plaçant la rétine sur le papier filtre. J'utilise la pince dans ma main gauche pour appuyer délicatement sur la sclérotique. Enfin, je découpe la rétine en tranches de 200 à 300 micromètres de large.

Ensuite, je choisis une coupe à utiliser pour mes expériences. Pour sélectionner une bonne coupe, je dois faire pivoter les tranches de 90 degrés afin de pouvoir observer les couches de la rétine. Je choisis une coupe qui semble intacte et qui présente des bandes horizontales bien distinctes indiquant les différentes couches.

Pour déplacer les lames d'une lame à une autre, je crée un pont de Ringer, puis je déplace soigneusement les lames à travers la solution. Lorsque je dépose la tranche, je la pousse contre les blocs en caoutchouc afin que le papier filtre soit orienté verticalement par rapport au verre. Maintenant, je suis prêt à effectuer l'enregistrement en configuration « patch clamp ».

Nous stockons la solution intracellulaire en petites portions au congélateur afin de décongeler uniquement la quantité dont nous avons réellement besoin pour une journée. Avant de remplir les électrodes, nous filtrons la solution pour éliminer les petites particules qui pourraient obstruer la pointe de l'électrode. Les électrodes de patch sont tirées à partir de capillaires en verre borosilicaté pour l'enregistrement des cellules ganglionnaires.

J'opte pour un réglage de tirage qui produira des résistances d'électrode comprises entre deux et quatre mégohms. Lorsque je remplis les électrodes, je veille à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air à l'extrémité de l'électrode. Donner de petits coups sur le verre avec le doigt permet d'éliminer les bulles.

Voici le porte-électrode fixé à l'étage de la tête. Le rouleau électro contient un fil de chlorure d'argent. C'est l'électrode de masse avec un pont niga.

Voici la pipette de perfusion. Elle est reliée à un système de microperfusion à huit canaux. La perfusion principale est assurée par gravité, il s'agit donc simplement d'une bouteille remplie de wingers, et la solution s'écoule à travers ce tube jusqu'à la chambre d'enregistrement.

Pour pouvoir enregistrer dans l'obscurité, j'ai une caméra infrarouge reliée au port latéral du microscope, qui est connecté à un écran de télévision. Sur le port supérieur, j'ai connecté un projecteur d'images, qui me permet de projeter des stimuli visuels sur la rétine. Et enfin, l'amplificateur de patch-clamp.

J'ajoute maintenant la tranche rétinienne sous le microscope et je place l'électrode de masse dans le bain afin de mettre en place la perfusion principale. Ensuite, j'ajoute le tube provenant du système de perfusion par gravité. Le tube en verre de l'autre côté est relié à une aspiration sous vide, ce qui maintient le niveau de fluide constant.

Je m'assure également qu'un tube d'aspiration est relié à l'électrode de l'épaule. Ensuite, je positionne la micropipette de perfusion. Je l'abaisse dans le bain en suivant l'objectif du microscope.

Dès que je m'approche de la tranche, je la recule légèrement afin que la solution atteigne celle-ci. Lorsque j'active la perfusion, je dois observer un léger mouvement de la tranche, comme ici. Cherchons maintenant une bonne cellule à partir de laquelle enregistrer.

Nous recherchons les cellules ganglionnaires, qui se trouvent au fond de la coupe. À présent, je prépare l'électrode ; avant de l'immerger dans le bain, j'ajoute une pression positive. Une fois que j'ai localisé l'électrode sous le microscope, je l'abaisse juste au-dessus de la coupe afin de réaliser le patch sur une cellule.

J'ai basculé vers l'objectif 40 x. J'effectue maintenant le réglage à zéro du courant de base et je vérifie la résistance de l'électrode. Le test d'étanchéité consiste en une série d'impulsions de 10 millivolts, ce qui me permet de vérifier si j'ai établi un joint étanche entre l'électrode et la cellule.

J'abaisse maintenant mon électrode sur la cellule cible. Dès que j'observe un affaissement sur le corps cellulaire, je relâche la pression positive dans le tube, ce qui établit un scellement étanche. La résistance est désormais si élevée que le tracé du courant apparaît plat.

Les petits pics sont des artefacts de capacité provenant de l'électrode. On peut compenser ceux-ci de cette manière, ils ont donc maintenant disparu. Je vais maintenant essayer de pénétrer dans la cellule.

Pour ce faire, j'applique soigneusement de petites impulsions d'aspiration sur le tube relié à l'épaule de l'électrode, et si tout fonctionne correctement, on observe un changement du tracé du courant comme celui-ci. Les pics que vous voyez maintenant sont traversés par la capacité membranaire et peuvent également être compensés. Il s'agit maintenant d'une préparation réalisée à l'obscurité. Voyons si nous pouvons enregistrer des réponses induites par la lumière.

La trace que vous pouvez voir sur l'oscilloscope est la réponse en courant d'une cellule ganglionnaire maintenue en voltage-clamp à moins 60 millivolts. Les stimuli lumineux que nous utilisons sont des barres claires et foncées présentées sur un fond uniforme constant. Le logiciel de notre laboratoire affiche l'enregistrement complet d'un essai.

On peut observer qu'il s'agit d'une cellule OFF en raison de sa réponse à l'apparition d'une barre sombre et à la disparition d'une barre lumineuse. La ligne blanche en haut indique la durée du stimulus. Nous pouvons désormais réaliser des expériences dans lesquelles nous perfusons différents agents pharmacologiques.

Par exemple, nous pouvons bloquer l'inhibition synergique GABAergique et glycinergique. Après avoir attendu moins d'une minute, nous pouvons généralement commencer à observer les effets du médicament ici. La réponse est devenue plus forte et plus prolongée.

La préparation de tranches rétiniennes est largement utilisée pour enregistrer les courants synaptiques provenant de différentes cellules de la rétine, et si l'on ajoute un colorant fluorescent à la solution électrolytique, le type cellulaire peut être facilement identifié. Sur le plan anatomique, nous utilisons ici la salamandre TGA larvaire comme modèle animal. Le fait que les salamandres soient des animaux à sang froid et possèdent de grandes cellules rétiniennes offre des conditions d'enregistrement avantageuses, mais la même technique peut être appliquée à des préparations de mammifères.