Immunoprécipitation de la chromatine des cellules souches embryonnaires humaines

Bonjour, je suis Stefan Burani du laboratoire du Dr. Frank Zawa, du département de biochimie de l'Université de Californie à Riverside. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure d'immunoprécipitation de la chromatine. Commençons donc.

Cette procédure commence par la réticulation à l'aide de formaldéhyde de cellules souches embryonnaires humaines. Avant la réticulation, les cellules souches embryonnaires humaines sont décongelées pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius, puis lavées avec du milieu. Les cellules sont ensuite ensemencées dans des plaques de six puits revêtues de gélatine et laissées se développer pendant deux à trois jours.

Pour chaque réaction d'immunoprécipitation, il faut partir de 50 à 100 millions de cellules. Les cellules sont d'abord lysées et recueillies en suspension. Un agent frais d'aldehyde est ajouté à chaque suspension cellulaire à une concentration de 1 % et incubé pendant 10 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un dixième du volume d'une solution de glycine à 1,25 molaire pour bloquer le formaldéhyde et incubez pendant 10 minutes. Lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS, puis transférez-les dans des tubes coniques de 50 millilitres. Faites centrifuger les tubes à 1 000 tr/min pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius afin de recueillir les cellules sous forme de culot.

Après la centrifugation, éliminer le surnageant et resuspendre le culot dans 1,5 millilitre de tampon lyse. Enfin, transférer les cellules dans un tube microfuge de 1,5 millilitre. Une fois les cellules transférées, les congeler rapidement trois fois dans l'azote liquide, puis les lyser à l'aide d'un broyeur tissulaire.

Une fois les cellules réticulées, elles sont prêtes pour l'immunoprécipitation ou peuvent être conservées congelées indéfiniment à moins 80 degrés Celsius. Une fois que vous avez réticulé les cellules, vous devez préparer les billes magnétiques pour effectuer cette étape. Ajoutez 50 microlitres de billes DI dans des tubes microcentrifuges de faible rétention de 1,5 millilitre, en préparant un tube de billes par immunoprécipitation.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de blocage. Récupérez maintenant les billes magnétiques à l’aide du MPC magnétique. Placez les tubes dans le support magnétique.

Laissez les billes s'accumuler sur le côté du tube. Cela devrait prendre environ 15 secondes. Vous pouvez retourner le porte-échantillons deux fois pour aider à rassembler les billes.

Une fois les billes collectées, vous pouvez éliminer l'état à l'aide d'une pipette. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez un millilitre de solution de blocage et resuspendez délicatement les billes en retirant la bande magnétique du support et en retournant le support. En gardant le tube en place, effectuez cette opération de 10 à 20 fois ou jusqu'à ce que les billes soient uniformément réparties.

Resuspendez et récupérez les billes comme vous l'avez fait précédemment. Une fois récupérées, vous pouvez éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette. Répétez ce lavage en utilisant 1,5 millilitre de solution de blocage.

Après le deuxième lavage, vous pouvez resuspendre les billes dans 750 microlitres de solution de blocage, puis ajouter 10 microgrammes d'anticorps. Dans nos recherches, nous utilisons un anticorps dirigé contre la protéine MLL, et nous incubons le mélange à quatre degrés Celsius pendant au moins six heures ou toute une nuit sur un agitateur rotatif. Pendant cette incubation, vous pouvez soniquer votre chromatine cross-linkée, ce que nous démontrerons peu après l'incubation nocturne.

Éliminez la solution d'anticorps, puis lavez les billes trois fois. Utilisez un millilitre de tampon lyse comme précédemment, en utilisant le support magnétique pour récupérer les billes. Après les lavages, vous êtes prêt à ajouter votre chromatine saturée.

Avant de commencer la sonication, vous devez d'abord récupérer les culots cellulaires congelés à moins 80 degrés Celsius et les laisser décongeler. Préparez un tube conique de 15 millilitres pour la sonication. Pour ce faire, coupez le tube en deux parties au niveau du trait de 5 millilitres et jetez la moitié supérieure.

Les tubes peuvent être recouverts de parafilm ou du bouchon du tube. Pendant la mise en place, utilisez un support à tubes pour positionner le tube de manière à ce que la sonde ator soit située à environ 0,5 à un centimètre au-dessus du fond du tube.

Veillez à ce que la sonde soit centrée et ne touche pas le côté du tube afin d'éviter la formation d'écume dans la solution. Soniquez maintenant la suspension pendant six cycles de 20 secondes. Chaque échantillon doit être conservé dans un bain d'eau glacée entre les cycles de sonication pour réduire la formation d'écume.

Réglez initialement la puissance à zéro, puis augmentez-la manuellement jusqu'à la puissance finale pendant la première impulsion. Après une certaine agitation, transférez le matériau dans un tube de 1,5 millilitre, puis centrifugez à 13 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Pour former un culot avec les débris et récupérer le sna.

Transférez la SINA dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Conservez 50 microlitres du lysat cellulaire de chaque échantillon comme ADN témoin. Ceci sera utilisé ultérieurement pour vérifier la taille de la chromatine partagée.

Cela peut être conservé à moins 20 degrés Celsius. Au moins un aliquot d'ADN d'entrée doit être conservé par lot de lysat soniqué. Nous sommes maintenant prêts à immunoprécipiter la chromatine pour précipiter l'acide aminé de la chromatine.

Tout d'abord, ajoutez l'équivalent de chromatine de 50 à 100 millions de cellules provenant du sating recueilli à l'étape précédente au mélange magnétique d'anticorps de 50 microlitres que nous avons préparé précédemment, pour un volume final d'un millilitre. Si nécessaire, ce volume peut être ajusté avec du tampon lyce invert afin de resuspendre. Incubez ce mélange avec les billes toute la nuit sur l'agitateur à quatre degrés Celsius.

Après l'incubation, récupérez les billes à l'aide du dyl MPC en plaçant les tubes dans le porte-échantillons, ce qui permet aux billes de s'accumuler sur la paroi du tube. Cette étape devrait prendre environ 20 secondes ensuite. Tapez deux fois sur le porte-échantillons pour aider à rassembler toutes les billes.

Ensuite, retirez le surnageant à l’aide d’une pipette en changeant les embouts entre chaque échantillon. Puis, nous devons laver les billes. Pour ce faire, ajoutez un millilitre de tampon lyse à chaque tube et resuspendez délicatement les billes.

Cela peut être réalisé en retirant la bande magnétique du support et en inversant le support avec les tubes toujours en place environ 10 à 20 fois, ou jusqu'à ce que les billes soient uniformément resuspendues. Ensuite, récupérez les billes en remettant la bande magnétique en place. Éliminez le surnageant à l’aide d’une pipette.

Répétez ce lavage trois à cinq fois supplémentaires. Pensez à changer les pointes entre chaque lavage. Ensuite, lavez les billes quatre à six fois dans un millilitre de tampon IP un, comme décrit précédemment.

Ensuite, laver de la même manière les billes quatre à six fois dans un millilitre de tampon IP2. Enfin, laver les billes quatre à six fois dans un millilitre de tampon TE à pH 8,0, comme effectué pour les autres lavages. Éliminer le tampon TE après le dernier lavage.

Maintenant, centrifuger à 3000 tr/min pendant trois minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer tout tampon TE résiduel. Les billes sont maintenant prêtes pour l'élution afin de récupérer la chromatine. Ajouter d'abord 210 microlitres de tampon d'élution et éluer le matériel des billes en incubant les tubes dans un mélangeur thermique à 65 degrés Celsius à 800 tr/min pendant 15 minutes, ou jusqu'à 30 minutes pour améliorer la récupération de l'éluate.

Faire centrifuger les billes à 13 000 tr/min pendant une minute. Après la centrifugation, prélever 200 microlitres du surnageant et transférer dans un nouveau tube, puis ajouter 200 microlitres de tampon TE 0,0. Nos échantillons sont désormais prêts à être soumis à une réversion du réticulage pour isoler l'ADN précipité.

Incuber le surnageant dans un bain-marie à 65 degrés Celsius pendant un minimum de six heures et un maximum de 15 heures. Cette incubation peut être effectuée dans un bain-marie afin de minimiser la condensation. Ensuite, suivre les 50 microlitres d'ADN témoin.

Cela a été réservé après la sonication ; la réversion du cross-linking de cet ADN témoin a été effectuée en l'incubant à 65 degrés Celsius, comme cela a été fait avec l'éluat. Nous sommes maintenant prêts à purifier l'ADN. L'ADN est ensuite purifié et précipité par une extraction au phénol-chloroforme, suivie de techniques de précipitation à l'éthanol.

Les culots d'ADN précipités sont resuspendus dans de l'eau, puis peuvent être conservés à moins 20 degrés Celsius. Pour une utilisation ultérieure, l'ADN d'entrée purifié peut être analysé sur un gel d'agarose afin de vérifier la taille du chromatine fragmenté. Idéalement, la taille devrait être comprise entre 250 et 750 paires de bases.

Nous venons donc de vous montrer comment réaliser une immunoprécipitation de la chromatine à partir de cellules souches embryonnaires humaines. Lorsque vous effectuez cette expérience, il est important d'utiliser un anticorps à haute affinité pour la chromatine, avec la plage de taille appropriée, ainsi que des étapes de lavage de haute stringence. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance pour vos expériences.