L'isolement des premiers cellules souches hématopoïétiques de murin sac vitellin et AGA

Cette vidéo montre comment les micro-dissection du sac vitellin et l'aorte-gonades-mésonéphros région à partir d'embryons et l'utilisation de cytométrie en flux à trier les cellules souches hématopoïétiques.

Dans l’embryon de souris. L’hématopoïèse précoce se produit simultanément dans plusieurs organes, notamment un sac vitellin, un aiguillon de l’aorte, la région mérisophale. Plus important encore, les cellules souches hématopoïétiques précoces peuvent être isolées de ces organes par microdissection de l’embryon, suivie d’un tri cytométrique en flux pour obtenir une population plus pure.

Dans cette vidéo, nous montrons la procédure de microdissection que nous utilisons couramment et montrons également les résultats d’un tracé de télécopie typique. Bonjour, je suis Kelly Morgan du laboratoire du Dr Gary Gilland à l’Institut médical Howard Hughes et du Département de médecine au Brigham and Women’s Hospital et j’ai été officiellement formée par Elaine Dza au Centre médical de l’Université Rasmus à Rotterdam. Aujourd’hui, je vais vous montrer la procédure de dissection embryonnaire pour obtenir des cellules souches hématopoïétiques précoces à partir du sac vitellin et de l’aorte, de la région aiguillonnée du meph ou d’un GM. Et je m’appelle Michael Care.

Également du Go Lab. Je vais vous montrer comment faire des suspensions unicellulaires d’un GM et de cellules vitellines pour les CSH en utilisant des faits. Cette procédure implique la dissection des organes hématopoïétiques précoces à partir d’embryons E 10 et demi miroirs, la dissociation des tissus et des faits de suspensions unicellulaires pour isoler les cellules souches hématopoïétiques.

Alors commençons. Avant de commencer, il est important d’avoir tous les réactifs et outils nécessaires à la procédure. Ciseaux, pinces, taille quatre, pinces à pointe courbée de qualité chirurgicale taille cinq 40 cinquièmes, aiguilles de calibre 30 avec seringue, boîtes de Pétri de 35 millimètres et 100 millimètres PBS avec 10 % et 20 % de sérum bovin fœtal et de collagénase.

Pour commencer la dissection, nous devons d’abord récolter les hordes utérines d’une femelle enceinte. 10 jours et demi après le concept, l’abdomen de la femelle est mouillé avec de l’éthanol, puis la peau est ouverte avec des ciseaux qui maintiennent la peau avec des pinces. Des coupes supplémentaires sont faites pour ouvrir le péritoine.

Maintenant, l’abdomen est ouvert et les cornes utérines peuvent être visualisées. À l’aide d’une pince pour tenir les cornes utérines, coupez chaque extrémité distale et le centre pour exciser les deux cornes. Les cornes utérines sont ensuite placées dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid et 10 % FBS.

Pour prélever le tissu utérin à l’aide d’une pince de taille quatre et au microscope, retirez délicatement le tissu endométrial autour de chaque embryon. Conceptus faisant attention à ne pas percer le placenta. Une fois retirés, les embryons sont placés dans une boîte fraîche avec du PBS froid et 10 % FDS retire soigneusement le tissu placentaire pour révéler l’embryon enfermé dans le sac à dechets.

Cela se fait en utilisant la pince pour couper l’embryon, en enfermant le sac vitellin loin du placenta. À leur jonction, le sac vitellin contenant les artères vilines et une partie du cordon ombilical peut être doucement retiré de l’embryon et mis de côté sur de la glace. Pour la dissociation, l’embryon est déplacé dans une petite boîte de Pétri avec des niveaux minimaux de PBS avec 10 % FBS juste assez pour mouiller l’embryon, mais pas trop.

Des niveaux optimaux maintiendraient l’embryon immobile pendant que la plaque était lentement agitée. Cela maintiendra l’embryon en place pendant la dissection. Passez aux aiguilles de calibre 30 pour retirer les parties supérieure et inférieure de l’embryon en coupant au-dessus du LIMS et en dessous des membres postérieurs.

Se familiariser avec l’utilisation des aiguilles comme instruments de coupe peut demander un peu de pratique. Répétez les petites incisions en croisant les aiguilles pour disséquer le tissu. Utilisez une aiguille comme guide pendant que l’autre effectue les coupes.

Ensuite, retirez la partie dorsale de l’embryon. Il s’agit d’un tissu qui contient les somites. Ceci est accompli en coupant doucement le tissu MOS dorsal tout en restant à une distance suffisante de l’aorte pour éviter toute entaille.

L’ablation de l’aorte entraînerait une perte de sang et l’impossibilité de visualiser facilement son emplacement. Encore une fois, faites de petites entailles avec les aiguilles au besoin pour maintenir un emplacement de coupe précis. Repoussez le tissu supplémentaire hors de vous et retournez l’embryon pour couper le tissu ventral.

Encore une fois, coupez aussi près que possible de l’aorte sans l’entailler. Des coupes faites trop loin de l’emplacement optimal entraîneraient la présence de tissus abdominaux, qui peuvent être retirés une fois que le GM A est isolé. Positionnez maintenant l’embryon avec le dos vers le bas, ou le dos contre la plaque.

Ouvrez doucement l’embryon en poussant les côtés vers le bas et en visualisant l’emplacement des crêtes gonadiques. Ceux-ci sont situés légèrement décentrés sous forme de structures tubulaires de chaque côté de l’aorte. Complétez la dissection en enlevant l’excès de tissus latéraux, en utilisant les mêmes techniques de coupe que précédemment.

Une fois que le tissu latéral de l’embryon est retiré, l’embryon est retourné pour retirer le tissu latéral restant. À ce stade, l’A GM est inspecté pour tout excès de tissu qui peut être facilement enlevé avec les aiguilles sans blesser l’aorte ou l’aiguillon. L’élimination de l’excès autant que possible permet un meilleur isolement de la population de cellules souches.

Puisque nous ne comptons que sur quelques marqueurs de surface cellulaire pour la purification. À l’aide de la pince à pointe pliée, prélevez délicatement chaque A GM et placez du PBS froid avec 10 % FBS jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la dissociation. Maintenant, pour dissocier les tissus, placez d’abord le sac vitellin et les AG GM dans des tubes séparés, tournez brièvement pour couper les tissus en granulés et jetez le PBS avec 10 % de tissus en suspension FBS et 0,25 % de collagénase dans le PBS avec 20 % FBS avec un volume suffisant pour couvrir adéquatement les tissus.

Incuber les tissus à 37 degrés, 25 à 30 minutes pour les AGM et 35 à 40 minutes pour les sacs vitellins. À la fin de l’incubation, pipetez doucement les tissus de haut en bas pour les dissocier en suspensions unicellulaires. Lavez les tissus avec l’excès de PBS avec des granulés de 10 % FPS, les cellules et le résus en suspension dans du PBS stérile frais avec des cellules 10 % FBS sont maintenant prêts pour la coloration.

Et pour cela, je vais les remettre à Mike. Merci Kelly. Pour l’analyse par télécopieur, les cellules sont colorées selon les recommandations du fabricant.

Nous utilisons un fax aria de BD bios pour effectuer la cytométrie en flux. En raison de la taille et de la fragilité des cellules embryonnaires, l’ouverture de tri est ajustée pour un grand diamètre. La buse est réglée à 100 microns et la pression de tri est de 30 PSI.

Pour l’analyse des cellules souches, les marqueurs C kit C 34 et CD 41 sont isolés et triés à partir du sac vitellin et des doubles positifs. Les CD 34 du kit C sont isolés de l’A-G-M-V-F-X. Une intrigue typique ressemblerait à ceci.

Les cellules positives du kit C sont analysées pour les CD 34 et 41 simultanément ou individuellement. Habituellement, les cellules affichent une gradation de positivité pour chaque marqueur. Avec la population de cellules souches trouvée comme un sous-ensemble des populations positives, ces graphiques nous montrent que nous avons atteint un bon rendement cellulaire avec 100 à 300 cellules par sac yap.

Et selon un MJ, nous venons de vous montrer comment disséquer et isoler des cellules souches hématopoïétiques précoces à partir d’un embryon de masse. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que le temps nécessaire pour terminer le protocole affecte négativement la viabilité cellulaire. Donc, en substance, plus vous pouvez terminer les dissections rapidement, meilleur sera votre rendement cellulaire.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.