Name: Marquage rétrograde de cellules ganglionnaires de la rétine par lapplication de fluoro-or sur la surface du colliculus supérieur (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Découvrez le marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine par application de fluoro-or sur le colliculus supérieur. Cette technique permet d'évaluer la survie cellulaire et les effets de médicaments en neurosciences.

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Les auteurs tiennent à remercier pour le soutien de National Glaucome Programme de la Fondation américaine adjointe de la santé.

<ol><li> Anesthésier le rat par injection intra-péritonéale de la kétamine (80mg/kg) et de xylazine (8mg/kg) (rapport de volume à 02h01). Appliquer une pommade stérile lubrifiant oculaire pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie. </li><li> Rasez les poils de tête (de l&#39;œil au niveau de l&#39;oreille) et fixer la tête sur la scène la tête par une tête de pince et fixer ses incisives dans la barre d&#39;incisive. </li><li> Désinfectée la zone d&#39;opération avec une solution de povidone iodée à 10%, suivi par l&#39;alcool à 70%. </li><li> Coupez la peau et des muscles afin d&#39;exposer le crâne et les sutures (sagittal, sutures coronale et transversale) (figure 1). Appliquer analgésique, bupivicaïne comme une éclaboussure zone d&#39;incision (à ne pas dépasser 2 mg / kg). </li><li> Percez un trou de crâne (ø 2x2 mm, 0,5 mm à la fois de sutures sagittale et transversale) de chaque côté de la suture sagittale. Eviter la rupture des méninges et des sinus couchent sous les sutures. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Poinçons sur le crâne de rat vivant." width="469" height="317" /> Figure 1. Poinçons sur le crâne de rat vivant. </li><li> Couper les méninges par des ciseaux à ressort, éviter les déchirements. </li><li> Aspirer le contenu cérébral qui se trouve sur la surface dorsale du colliculus supérieur avec soin par la pompe à vide et trois check-points peuvent être observés: <ol><li> la couleur de modifications du tissu cérébral du gris au blanc au gris </li><li> arrêt de l&#39;aspiration lorsque le fluide céphalo-rachidien incolore sortent </li><li> attentivement l&#39;agrandir au plus bas niveau d&#39;aspiration horizontalement afin d&#39;exposer le colliculus supérieurs jaunâtres couverts par la durée </li></ol></li><li> Aspirer le contenu du cerveau au cours SC jusqu&#39;à quatre bords de la SC peut être observé directement sous le microscope. La partie du cortex cérébral retirée doit être réduit au minimum afin d&#39;éviter des effets secondaires indésirables (par exemple, dysfonctionnement moteur). Soyez prudent de ne pas toucher les sinus. </li><li> Absorber le liquide dans le trou avec une bande de coton fin stériles pour rendre la surface de la SC aussi sec que possible. Ensuite, placez une fine couche de gélatine éponge imbibée de pré-Fluoro-Gold 6% sur la surface du SC (FG est repris par les terminaisons axonales des cellules ganglionnaires de la rétine et au niveau bilatéral transporté par voie rétrograde à son soma dans la rétine). </li><li> Remplissez le trou avec Gelfoam et fermer la plaie cutanée avec des clips de suture. </li><li> Les animaux ont été autorisés à récupérer sous la lampe à incandescence pour garder au chaud. Analgésique, la buprénorphine (100mcg/kg), est appliqué par voie orale dans l&#39;eau potable pour les 5 jours après l&#39;étiquetage SC. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> Pourquoi utiliser cette méthode chirurgicale pour la numération des cellules ganglionnaires rétiniennes? Chez le rat environ 98% des cellules ganglionnaires de la rétine (CJR) sont connus pour des projets à l&#39;controlatéral colliculus supérieur (CS). Application fluoro-or sur la surface de l&#39;étiquette SC peut presque tout le CGR, de sorte que nous pouvons nous concentrer sur ce neurone rétinien plus vulnérables dans le glaucome. Comparer avec marquage rétrograde de RGC en mettant FG au moignon du nerf optique sectio...

marquage rétrograde de cellules ganglionnaires de la rétine par l&#39;application de fluoro-or sur la surface du colliculus supérieur

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) de comptage est essentiel d&#39;évaluer la dégénérescence rétinienne notamment dans le glaucome. Fiable étiquetage CJR est fondamentale pour évaluer les effets de tout traitement. Chez le rat, environ 98% des CGR est connu pour des projets à l&#39;controlatéral colliculus supérieur (CS) (Forrester et Peters, 1967). Application fluoro-or (FG) sur la surface de l&#39;étiquette SC peut presque tout le CGR, de sorte que nous pouvons nous concentrer sur ce neurone rétinien plus vulnérables dans le glaucome. FG est repris par les terminaisons axonales des cellules ganglionnaires de la rétine et au niveau bilatéral transporté par voie rétrograde à son soma dans la rétine. Comparer avec marquage rétrograde de RGC en mettant FG au moignon du nerf optique sectionné pendant 2 jours, l&#39;ingérence de la survie du CJR est minimisé. Comparer avec coloration violet de crésyl que CGR taches, les cellules amacrines et de l&#39;endothélium des vaisseaux sanguins dans la couche des cellules ganglionnaires de la rétine, cette méthode d&#39;étiquetage est plus spécifique à la CJR. Cette vidéo décrit la méthode de marquage rétrograde de RGC en appliquant FG sur la surface du SC. Les procédures chirurgicales comprennent le forage du crâne; aspirer le cortex pour exposer le SC et en appliquant une éponge de gélatine sur la surface dorsale entière de SC sont présentés. Conseils utiles pour éviter une hémorragie intracrânienne et l&#39;aspiration de la SC ont été donnés.

Cette vidéo décrit la méthode de marquage rétrograde de RGC en appliquant fluoro-or (FG) sur la surface du colliculus supérieur (CS). Technique consiste à percer le crâne, l&#39;aspiration du cortex, et en appliquant une éponge de gélatine sur la surface dorsale entière de SC.

Marquage rétrograde de cellules ganglionnaires de la rétine par l&#39;application de fluoro-or sur la surface du colliculus supérieur

Le comptage des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) est essentiel pour évaluer la dégénérescence rétinienne, en particulier dans le cas du glaucome. Un marquage fiable des CGR est fondamental pour...

Bonjour, je suis Tu du laboratoire GOSO à l'Université de Hong Kong. Aujourd'hui, je vais présenter comment étiqueter rétrogradement le rat. Cellule ganglionnaire rétinienne.Les cellules ganglionnaires de la rétine seront marquées de façon rétrograde en appliquant un colorant fluorescent sur la surface du collicule supérieur afin que, par la suite, nous puissions dénombrer les cellules ganglionnaires rétiniennes sur la préparation rétinienne à plat pour évaluer la mort cellulaire ou l'effet du médicament appliqué. Cette photo illustre la voie partant de la rétine vers le collicule supérieur. La diadcylcarbocyanine fluorescente (DiA) peut être transportée de manière rétrograde depuis le collicule supérieur jusqu’au long du tractus optique.Faites passer le chiasma optique par le nerf optique jusqu'à la rétine dans l'œil. Nous utilisons un microscope opératoire pour réaliser la chirurgie. Utilisez une pompe d'aspiration pour retirer le cortex cérébral au-dessus de la surface dorsale du dispositif d'immobilisation CLE afin de maintenir le chapeau rouge en position.Ke et sine pour la préparation du foret à rat destiné à l'ouverture du crâne et du poncement absorbable pour l'application du colorant fluorescent FG sur la surface du crâne. Les instruments ont été stérilisés à l'autoclave avant l'intervention, notamment les pinces fines, les ciseaux à ressort, l'aiguille sous vide, la pointe de forage et les agrafes de suture. La lame chirurgicale pour inciser la peau, la règle pour les mesures et le coton sont également en condition stérile.Nous analysons le rouge par injection tonale de kétamine et de gel de sine. Après avoir rasé l'adver depuis le niveau des yeux jusqu'au niveau des oreilles, nous avons désinfecté la zone opératoire avec de la propane iodine, suivie d'alcool à 70 %. Ensuite, nous avons mis le chapeau rouge en place sur le support de tête.Inciser la peau en ligne médiane de la tête, en partant du niveau de l'œil jusqu'au niveau des oreilles. On obtient ainsi une bonne exposition de la suture coronale, de la suture sagittale, de la suture transverse, et ceci est le BMA et ceci est le Lambda. Marquer la vis à 0,5 à un millimètre de la suture transverse AL et étiqueter ensuite les deux côtés de manière symétrique afin de s'assurer que la marque se trouve à au moins 0,5 millimètre des sutures.Ensuite, nous pouvons commencer à percer un trou le long du côté marqué, en contrôlant la vitesse et la direction du foret afin d'obtenir une rupture étendue des méninges et de la muqueuse sinusoïdale situées sous la suture. Arrêtez le perçage lorsque le diamètre atteint environ deux millimètres. Puis, nous recommençons de l'autre côté, en miroir, afin de vérifier que le trou présente la bonne taille et se situe au bon emplacement.Ouvrir les méninges avec la paire de ciseaux à ressort, utiliser une pince fine pour nettoyer les débris osseux présents dans le trou. Nous pouvons maintenant commencer l'aspiration à l'aide de la pompe à vide. La première couche du BR est la substance grise, que l'on coupe à nouveau avec les méninges.Ensuite, vous pouvez observer la couleur des cellules T qui devient blanche. Ce sont donc les substances blanches du sérum. Effectuez l'aspiration lentement et soigneusement.On peut donc à nouveau voir les matières grises. La couleur devient moins blanche. On peut constater qu'elle est grise au fond.Je vois. Vous pouvez observer ici que le LCR clair s'écoule. Cela signifie que nous atteignons la surface dorsale du corps calleux supérieur.Encore une fois, un trou agrandi au niveau de cette région. Ensuite, au fond, on peut observer la dure-mère de couleur jaunâtre recouvrant le clus supérieur. Effectuez une aspiration horizontale à ce niveau afin d'éviter de détériorer le contenu du clus supérieur.Ensuite, nous pouvons commencer l'ensemble. Vous voyez la matière verte. C'est en réalité de couleur verte.Ensuite, nous arrivons à la substance blanche. La couleur du tissu est blanche. Vous pouvez maintenant voir le LCR apparaître joliment sous cette teinte grise.Retirez cette dernière couche de matière grise, puis la dure-mère jaunâtre est exposée. Faites attention à présent de sectionner la dure-mère au-dessus des différents cliquets, puis agrandissez l'orifice. Essayez de vous assurer que tout le bord des cliquets puisse être observé au microscope.Prenez le serre-tête du support de tête selon différents angles et effectuez une aspiration finale jusqu'à ce que les quatre bords du CLE soient visibles directement au microscope. Absorbez le liquide présent dans le trou à l’aide d’une fine bande de coton afin de rendre la surface du CLE aussi solide que possible. Prenez un morceau de gélatine, enduit préalablement de 6 % d’or colloïdal, et divisez-le en plusieurs petits morceaux.Étalez-le en une fine couche dont la taille est légèrement supérieure à celle de toute la surface dorsale du supérieur. Placez-le soigneusement sur la surface des cliquetis supérieurs, puis sur le côté opposé. Insérez-le dans le trou en recouvrant entièrement la surface du clus à travers les orifices avec un jaillissement de plus en plus faible.Enfin, fermez la plaie cutanée à l’aide de clips de suture, nettoyez la plaie après l’intervention chirurgicale, replacez le rat dans une cage propre et laissez-le se remettre. Maintenez des conditions chaudes. Le rat se comporte normalement après l’opération lorsqu’il est éveillé.Sept jours après le marquage SC, nous disséquons la rétine et la montons à plat, puis comptons les cellules ganglionnaires rétiniennes au microscope épifluorescent en utilisant un filtre UV. Étant donné que 98 % des cellules ganglionnaires rétiniennes projettent vers les colliculus supérieurs, un marquage fiable du SC est fondamental pour évaluer la progression de la maladie et l'effet des médicaments. Voici un exemple de cellule ganglionnaire rétinienne marquée de façon rétrograde sur une rétine montée à plat.

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Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Transection du nerf optique est un modèle largement utilisé de blessure SNC adulte. Ce modèle est idéal pour effectuer un certain nombre de manipulations expérimentales qui ciblent la rétine au niveau mondial ou directement pour cible la population blessés neuronale des cellules ganglionnaires de la rétine.

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Découvrez le marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine par application de fluoro-or sur le colliculus supérieur. Cette technique permet d'évaluer la survie cellulaire et les effets de médicaments en neurosciences.

Marquage rétrograde de cellules ganglionnaires de la rétine par lapplication de fluoro-or sur la surface du colliculus supérieur (Vidéo) | JoVE Journal

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