Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Bonjour, je suis Lauren Frank du laboratoire d'Emmanuel Pothos, Département de pharmacologie et de thérapeutique expérimentale à la faculté de médecine de l'Université Tufts. Et moi, c'est Emmanuel Pothos. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'obtenir des cultures primaires de cellules dopaminergiques du mésencéphale à partir de rongeurs néonatals.

Cette procédure comprend les étapes suivantes : préparer les outils et les réactifs, disséquer le mésencéphale de cerveaux de rongeurs âgés de P0 à P2, segmenter les cerveaux et ensemencer les neurones dissociés. Commençons donc.

Dans le cadre de cette procédure, plusieurs étapes de préparation doivent être effectuées au préalable, deux à trois semaines avant la mise en culture des neurones dopaminergiques. Les cellules gliales doivent être ensemencées afin qu'elles aient le temps de proliférer et de recouvrir le fond des boîtes. Les neurones dopaminergiques primaires seront cultivés sur une monocouche de cellules gliales un à sept jours avant la culture primaire des cellules neuronales. Retirer le milieu des cellules gliales et le remplacer par deux millilitres de milieu neuronal frais la veille de la culture AC. Tous les éléments, à l'exception des instruments de dissection, doivent être stérilisés par lumière UV, y compris 12 plaques de dissection.

Deux fioles de dissociation avec une barre magnétique microscopique. Deux bouchons de fiole avec deux petits trous percés en haut. Anneaux coulissants déployés.

Et la boîte à bagues porte-lames, n'oubliez pas de la laisser ouverte. Tous ces outils sont enduits d'éthanol à 70 % avant le début de la journée de culture. Tout d'abord, prenez tous les constituants de la solution de pepane qui seront utilisés pour dissocier la solution de neurones primaires du congélateur et laissez-les décongeler.

Configurer une plaque chauffante pour chauffer un bécher d'eau à 34 degrés Celsius afin de procéder à la digestion, et préparer de l'eau saturée en carbogène pour l'oxygénation de la solution de pepane. Pendant la digestion, 15 tubes stériles remplis de quatre à six millilitres de PBS stérile pour le lavage des cerveaux avant la dissection sont préparés et placés sur de la glace. Vingt à trente millilitres de milieu neuronal frais sont prélevés et placés dans l'incubateur.

Ensuite, on prépare le flacon de dissociation en utilisant une unité de filtration stérile à bouchon pour filtrer la solution de pepane, que l'on transfère ensuite dans le flacon de dissociation à l’aide d’un bouchon fileté de 25 millilitres ; insérez une seringue stérile, percez un trou dans le bouchon, qui est relié à un filtre de 0,2 micron. Connectez le carbogène au filtre et fixez-le en place avec du parafilm. Placez le flacon dans le disque en polystyrène.

Une fois le flacon de dissociation en place, s'assurer que l'agitateur magnétique est en mouvement. Le gaz pénètre dans le flacon et la température est stabilisée à 34 degrés Celsius. La loupe binoculaire est placée dans la hotte et les instruments de dissection sont disposés sur du papier d'aluminium.

Ensuite, déployez un grand carré de papier d'aluminium et 12 carrés plus petits. Laissez une paire de ciseaux destinée aux décaptations avec le papier d'aluminium. Placez une boîte en polystyrène remplie d'eau glacée à l'extérieur de la hotte.

Ensuite, préparez l'anesthésique, qui est un mélange de 0,075 millilitre de kétamine et de 0,075 millilitre de xylazine. Puis récupérez au moins 12 souriceaux de P0 à P2 pour des boîtes de 135 millimètres avec un insert en verre de 23 millimètres. Pour les souris, assurez-vous qu'il y ait une correspondance de génotype pour toute la portée.

Si le génotype est inconnu, les cellules de chaque animal devront être mises en culture dans des boîtes séparées et des registres précis devront être tenus afin d'associer les cellules aux résultats ultérieurs de génotypage. Pour commencer la dissection, anesthésiez le premier animal par une injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine. Lorsque l'animal ne réagit plus à un test de pincement de la queue, placez-le dans de l'eau glacée pendant 30 secondes jusqu'à ce qu'il devienne hypothermique.

Ensuite, rincez une petite feuille d'aluminium avec de l'éthanol à 70 %, ainsi que les ciseaux de découpe et la tête de l'animal, afin d'éviter toute contamination du tissu cérébral pendant la dissection. Découpez la tête à l'aide des ciseaux, laissez-la tomber sur la feuille d'aluminium et déplacez-la sous la hotte. Retirez délicatement le cerveau en incisant d'abord la peau avec les petits ciseaux pour exposer le crâne. Effectuez une incision circulaire autour du crâne sur 360 degrés.

Ensuite, retirez le capuchon crânien avec une pince. Soulevez le cerveau du crâne à l’aide d’une petite spatule et placez-le dans un tube de 15 millilitres contenant de la glace. Plongez le tube dans du PBS froid et remettez-le sur la glace avant de retirer le cerveau suivant.

Répétez les dissections jusqu'à ce qu'il y ait trois cerveaux dans des tubes séparés placés sur de la glace. Versez un cerveau et du PBS sur la première boîte de dissection. Sous le microscope, placez le cerveau sur une plateforme en colle sill guard agissant comme coussin afin que la lame reste affûtée.

Utilisez une pipette de transfert pour placer les segments dans un tube neuf contenant du PBS afin de laver les segments avant de les transférer dans la solution de papaine. Démarrez un minuteur lorsque les premiers segments sont placés, puis poursuivez les dissections jusqu'à ce que tous les cerveaux soient en cours de digestion. Dans la solution de papaine.

Les premiers segments cérébraux auront été en digestion pendant environ une heure. Dès que les derniers segments sont ajoutés, laissez la digestion se poursuivre pendant une heure supplémentaire. Assurez-vous que la température du bain pepane est stabilisée à 34 degrés Celsius.

Pour commencer l'étape de rotation, utilisez une pipette de transfert pour placer les segments de cerveau dans un tube stérile de 15 millilitres. Essayez d'éviter d'amener une quantité excessive de solution de pepane. Toutefois, si cela se produit, retirez l'excès de pepane.

Ensuite, lavez les segments en ajoutant deux millilitres de milieu neuronal réchauffé provenant de l'incubateur. Laissez les segments se déposer, puis éliminez soigneusement autant de solution que possible sans perturber les segments. Effectuez un total de trois lavages.

Pensez à changer les pipettes entre les lavages afin d’éviter toute contamination, en utilisant une pipette neuve à chaque transfert. Commencez les itérations dans deux millilitres de milieu neuronal. Effectuez 25 pipetages, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.

Ensuite, laissez reposer les segments non associés pendant trois minutes. Utilisez une pipette de transfert pour récupérer autant de surnageant que possible, sans perturber les segments au fond. Conservez le surnageant dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres.

Répétez l'étape précédente en utilisant une pointe de pipette de 1000 microlitres, puis une pointe de 200 microlitres, après quoi les segments doivent apparaître complètement dissociés à l'œil nu. Le surnageant de toutes les étapes est recueilli dans le même tube de 15 millilitres. Nous sommes prêts à ensemencer les cellules ; effectuez finalement 10 passages à la pipette de transfert afin d'obtenir une suspension cellulaire homogène pour le comptage.

À l’aide d’une pointe de pipette jaune stérile, recouvrez chaque extrémité de la pince. Déposez délicatement un anneau à lame aussi centré que possible sur le verre. Dans chaque boîte, ces anneaux serviront à isoler une zone dans la boîte de culture où les neurones seront ensemencés.

Utilisez la pointe de pipette pour faire glisser les bagues sur la cavité centrale de chaque boîte. Ajoutez ensuite délicatement le volume approprié de cellules dans la boîte. Ajoutez les cellules au centre de la bague que vous avez déjà placée dans la boîte.

N'oubliez pas de changer les embouts pour chaque boîte. Ensuite, ajoutez cent microlitres de solution de GDNF diluée aussi près que possible de l'extérieur de l'anneau de chaque boîte afin de favoriser la prolifération des neurones. Ensuite, l'inhibiteur de mitose, la fluorodésoxyuridine ou FDU, est ajouté à l'extérieur de l'anneau pour empêcher les cellules gliales de proliférer excessivement.

Les embouts de pipette retournent souvent à l’incubateur et permettent aux cellules de se déposer toute la nuit. Le lendemain, à l’aide d’embouts de pipette stériles pour recouvrir les extrémités de la pince, retirez les bagues, remettez les boîtes dans l’incubateur et manipulez-les le moins possible jusqu’au moment des expériences. Vérifiez quotidiennement les boîtes pour détecter toute contamination éventuelle, et si une contamination est observée, retirez immédiatement les boîtes problématiques. Les cultures sont prêtes à être utilisées en électrophysiologie, en expériences de biologie moléculaire et en immuno-cyto dans les trois semaines.

Maintenant que les cellules ont été ensemencées, examinons quelques exemples représentatifs de cellules en culture. Ici, nous observons une culture primaire ensemencée il y a 14 jours. Cet exemple illustre une bonne culture, car on distingue clairement les corps cellulaires avec leurs prolongements.

En outre, notez l'absence de toute croissance de moisissure ou de champignon dans la boîte, ce qui indiquerait une contamination. Nous venons de vous montrer comment générer des cultures primaires dissociées de cellules dopaminergiques du mésencéphale à partir de rongeurs néonats. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir un environnement stérile, d'utiliser uniquement des néonats de P0 à P2, de semer sur des substrats gliaux sains avec un milieu conditionné par les cellules gliales, et de maintenir une densité de semis constante.

Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.