Name: Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Apprenez à générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir de nouveau-nés de rongeurs. Cette méthode permet d'étudier la libération de dopamine et ses régulateurs.

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Le travail a été soutenu par DK065872 (PEV), un Prix Smith Family Foundation de l&#39;excellence en recherche biomédicale (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) et P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

Les méthodes décrites ici permettent de résolution fine des caractéristiques morphologiques et neurochimiques des neurones dopaminergiques centrales qui sont par ailleurs pas disponible dans une approche systémique ou dans l&#39;approche in vivo.

Les matériaux sont inclus dans le texte du protocole.

primaire dissocié cultures mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

La capacité à créer des cultures de cellules primaires de neurones à dopamine permet l&#39;étude des caractéristiques présynaptique des neurones dopaminergiques dans l&#39;isolement de l&#39;entrée systémique d&#39;ailleurs dans le cerveau. Dans notre laboratoire, nous utilisons ces neurones pour évaluer la cinétique de libération de dopamine en utilisant l&#39;ampérométrie en fibre de carbone, ainsi que les niveaux d&#39;expression des gènes liés dopamine et de protéines en utilisant la PCR quantitative et immunocytochimie. Dans cette vidéo, nous vous montrons comment nous générons ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs. Le processus comporte plusieurs étapes, y compris le placage de corticale astrocytes gliales, le conditionnement des milieux de culture cellulaire neuronale par le substrat gliales, la dissection du mésencéphale chez les nouveaux nés, la digestion, l&#39;extraction et le placage des neurones à dopamine et l&#39;ajout de facteurs neurotrophiques pour d&#39;assurer la survie cellulaire. Les applications appropriées pour une telle préparation comprennent l&#39;électrophysiologie, l&#39;immunocytochimie, PCR quantitative, la microscopie vidéo (ie, de la fusion vésiculaire en temps réel avec la membrane plasmique), des dosages de la viabilité cellulaire et d&#39;autres tests de dépistage toxicologique.

Primaire dissocié des cultures de cellules dopaminergiques du mésencéphale permettre l&#39;étude des caractéristiques des neurones à dopamine présynaptique. Ils peuvent être utilisés pour surveiller en temps réel des cinétiques de libération de dopamine et de la protéine / ARNm niveaux de régulation de l&#39;exocytose de dopamine. Ici, nous vous montrons comment générer ces cultures du nouveau-né contre les rongeurs.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

La capacité de créer des cultures primaires de neurones dopaminergiques permet l'étude isolée des caractéristiques présynaptiques de ces neurones...

Bonjour, je suis Lauren Frank du laboratoire d'Emmanuel Pothos, Département de pharmacologie et de thérapeutique expérimentale à la faculté de médecine de l'Université Tufts. Et moi, c'est Emmanuel Pothos. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d'obtenir des cultures primaires de cellules dopaminergiques du mésencéphale à partir de rongeurs néonatals.Cette procédure comprend les étapes suivantes : préparer les outils et les réactifs, disséquer le mésencéphale de cerveaux de rongeurs âgés de P0 à P2, segmenter les cerveaux et ensemencer les neurones dissociés. Commençons donc.Dans le cadre de cette procédure, plusieurs étapes de préparation doivent être effectuées au préalable, deux à trois semaines avant la mise en culture des neurones dopaminergiques. Les cellules gliales doivent être ensemencées afin qu'elles aient le temps de proliférer et de recouvrir le fond des boîtes. Les neurones dopaminergiques primaires seront cultivés sur une monocouche de cellules gliales un à sept jours avant la culture primaire des cellules neuronales. Retirer le milieu des cellules gliales et le remplacer par deux millilitres de milieu neuronal frais la veille de la culture AC

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JoVE Journal

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Biologie

Une méthode pour générer des tranches organotypiques de l'embryon murin E12.5 mésencéphale est décrite. Les cultures organotypique peut être utilisé pour observer le comportement des neurones dopaminergiques du mésencéphale ou d'autres neurones ventraux.

Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

Cette vidéo décrit une méthode de culture de neurones dopaminergiques à partir de tissu cérébral embryonnaire de souris. Le processus comprend le traitement du mésencéphale avec une enzyme protéolytique, le détachement des cellules et leur culture sur des lamelles enrobées de polymère dans un milieu riche en nutriments avec des antibiotiques pour leur croissance et leur viabilité à long terme.

Culture et maintien de neurones dopaminergiques à partir de tissu cérébral embryonnaire de souris

La vidéo montre le processus d’isolement et de culture des neurones dopaminergiques du mésencéphale d’embryons de souris. Les planchers ventraux isolés du mésencéphale sont dissociés à l’aide d’enzymes. Les neurones dopaminergiques qui en résultent sont récoltés et transférés dans des micro-îlots à l’intérieur de plaques multi-puits. Les cellules sont incubées avec un milieu neuronal dopaminergique pour maintenir les cellules à une densité élevée à l’intérieur des micro-îles.

Isolement et culture de neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de souris

Cette vidéo démontre le processus de quantification de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires de souris prétraités avec des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Il décrit les étapes de fixation, de coloration et de quantification des neurones dopaminergiques contenant des agrégats d’alpha-synucléine à l’aide de l’immunofluorescence.

Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

Nous, sur la base des connaissances de la biologie du développement et des recherches publiées, avons développé un protocole optimisé pour générer efficacement des neurones dopaminergiques A9 du mésencéphale à partir de cellules souches embryonnaires humaines et de cellules souches pluripotentes induites humaines, ce qui serait utile pour la modélisation de la maladie et la thérapie de remplacement cellulaire pour la maladie de Parkinson.

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Les neurones dopaminergiques jouent un rôle régulateur essentiel dans le cerveau. Leur perte est associée à la maladie de Parkinson. Dans cette vidéo, nous montrons comment générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques centraux à partir de mésencéphale embryonnaire de souris. De telles cultures sont utiles pour étudier l’extrême vulnérabilité de ces neurones à divers stress.

Culture primaire de souris dopaminergiques neurones

Les causes de la dégénérescence des neurones dopaminergiques du mésencéphale au cours de la maladie de Parkinson ne sont pas entièrement comprises. Les systèmes de culture cellulaire constituent un outil essentiel pour l’étude des propriétés neurophysiologiques de ces neurones. Nous présentons ici un protocole optimisé, qui peut être utilisé pour la modélisation in vitro de la neurodégénérescence.

Isolement, Culture et maintenance à long terme des mésencéphalique primaire dopaminergiques neurones à partir de cerveaux embryonnaires de rongeurs

Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.

Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l&#39;ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression

Le protocole présente la reprogrammation des cellules mononucléaires périphériques de sang pour induire des cellules souches neurales par l'infection de virus de Sendai, différenciation des iNSCs dans les neurones dopaminergiques, transplantation des précurseurs de DA dans le unilatéralement-lesioned Modèles de souris de la maladie de Parkinson, et évaluation de l'innocuité et de l'efficacité des précurseurs d'AD dérivés de l'iNSC pour le traitement de la MALADIE.

Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour étudier l’accumulation neuronale de α-synucléine dans les neurones primaires de dopamine de souris. Les agrégats α-synucléine phosphorylés dans les neurones sont induits avec des fibrilles préformées d’α-synucléine. L’imagerie automatisée des cellules immunofluorères et l’analyse impartiale de l’image rendent ce protocole robuste adapté au dépistage moyen à élevé des médicaments qui inhibent l’accumulation de synucléine.

Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Apprenez à générer des cultures primaires de neurones dopaminergiques du mésencéphale à partir de nouveau-nés de rongeurs. Cette méthode permet d'étudier la libération de dopamine et ses régulateurs.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

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