Name: De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Découvrez le maintien de cellules souches embryonnaires humaines sans couches nourricières sur Matrigel. Cette méthode inclut le repiquage continu et la confirmation de la pluripotence par immunofluorescence.

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Embryonnaires humaines études de cellules souches dans le laboratoire Teitell sont soutenus par un California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Subvention de démarrage RS1-00313. Nous remercions les membres du grand centre de médecine régénérative et de recherche sur les cellules souches à l&#39;UCLA, en particulier le Dr Clark Amander, le Dr Jerome Zack, et des membres de l&#39;UCLA large souches Facilité Institut noyau cellulaire pour leur soutien de nos études.

l&#39;entretien de la culture quotidienne de CSEh <ol><li> milieux de culture des CSEh doivent être changés toutes les 24 heures. De la bouteille ES stock de médias stockés à 4 ° C, sortir la quantité de solution nécessaire (~ 20ml par 6-même plaque), placer dans un tube de 50ml Falcon, et chaud à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Une fois que le média est réchauffé, ajouter le bFGF conservés à 4 ° C à une concentration finale de 10ng/ml. Mettez le stock bFGF revenir à 4 ° C immédiatement après usage! </li><li> Retirer des plaques de 6 puits, mais tous les ~ 500μl de médias. Assurez-vous de tourbillonner la boîte de culture de suspendre pour l&#39;enlèvement des débris. Assurez-vous que le bFGF dans les milieux de culture des CSEh est bien mélangé et ajouter 3 ml de milieux frais de retour à chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. Remettez la plaque dans l&#39;incubateur. </li></ol> Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel Habituellement, un confluentes 6-même assiette de CSEh le FAE peut être divisé 1:02-1:03 sur Matrigel plaques de 6 puits, avec les puits deviennent confluentes à nouveau 4-5 jours après fractionnement. <ol><li> Lorsque CSEh fractionnement sur Matrigel, MEF conditionné médias (CM) est utilisé pour maintenir la pluripotence. MEF-médias est conditionnée à l&#39;avance. Le premier jour, 1,5 × 10 7 γ-irradiés FAE sont ensemencées dans un flacon T75. Le deuxième jour, FAE sont lavés une fois avec une température ambiante x PBS, pH 7,4, puis 15ml de médias ES complétée par 5ng/ml bFGF est ajouté dans le ballon. (REMARQUE: FAE peuvent être étalées dans des flacons plus petits ou plus gros, mais la proportion entre la densité cellulaire et du volume des supports ES doit être constante.) Le flacon est incubé à 37 ° C pendant 24 heures. Le troisième jour, le CM est collectée et remplacé par 15 ml de médias ES frais complété avec 5ng/ml bFGF. Le CM collectées sont stockées à 4 ° C. MEF-conditionnée des médias d&#39;un placage de FAE sont récoltées pendant sept jours consécutifs de générer 15 × 7 = 105ml. Après sept jours, toutes les fractions sont combinées CM, filtration stérile, aliquotés et conservés à -20 ° C. CM des médias préparé comme décrit peut être stockée et utilisée pour 1 mois. </li><li> Un jour, avant de se séparer de CSEh, mis aliquotes dans des tubes eppendorf Matrigel à 4 ° C à dégeler la nuit (une aliquote contient 76.2mg de Matrigel, et ceci est la quantité nécessaire pour un 6-même plaque). Le jour de fractionnement, de prendre un flacon de Matrigel décongelées pour un 6-même assiette, mettre le flacon et 6ml de froid DMEM/F12 des médias sur la glace. Transférer le matrigel dans le DMEM/F12 médias et bien mélanger. Ajouter 1 ml de la solution à chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. Swirl la plaque de distribuer Matrigel en surface et incuber la plaque recouverte de Matrigel à température ambiante pendant au moins 1 heure avant de se séparer du CSEh. </li><li> CSEh le MEF sont lavées une fois avec 1 x PBS, pH 7,4. Par la suite 1ml d&#39;eau tiède collagénase IV (1mg/ml) est ajouté à chaque puits de la plaque de 6 puits, puis la plaque est incubée à 37 ° C pendant 5-10 min. </li><li> Ajouter 1ml de médias ES sans bFGF à chaque puits. Utiliser une pipette 1 ml de faire sauter les cellules souches de la plaque. Recueillir tous les médias contenant des touffes de CSEh et morts FAE dans un tube 50ml Falcon. Laissez gros amas de cellules se contenter de 5-10 min pour que les touffes de CSEh forment un culot au fond du tube tandis que la FAE restent en suspension dans le surnageant. Jeter le surnageant et laver à la remise en suspension le culot de CSEh ES en utilisant les médias manquent de bFGF, suivie par une centrifugation à température ambiante à 200g pendant 5 min. </li><li> Pour plaque de cellules souches sur des plaques de Matrigel, d&#39;abord laver les assiettes avec Matrigel DMEM/F12 température ambiante (1ml par puits) et en ajoutant 2,5 ml de CM complété avec 10ng/ml bFGF par puits. Reprendre le culot dans un volume approprié de CM complété avec 10ng/ml bFGF, une pipette la suspension cellulaire de haut en bas plusieurs fois jusqu&#39;à l&#39;amas devient uniforme et de petite taille. Aliquoter la suspension à 0,5 ml par puits sur la plaque de Matrigel. Notez que la densité des colonies sur Matrigel est plus élevée que la densité des colonies par fractionnement d&#39;habitude sur le FAE. Placer la plaque dans un 37 ° C de culture de tissu incubateur. </li><li> Pour maintenir la CSEh sur Matrigel, les médias CM complétée par 10ng/ml bFGF est changé toutes les 24 heures pour un maximum de 4-5 jours. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Cette vidéo montre comment les CSEh passage de plaques MEF pour les plaques d&#39;alimentation Matrigel sans cellule. Notez que la densité des colonies sur Matrigel est plus élevée que la densité des colonies par fractionnement d&#39;habitude sur le FAE. Immunofluorescence et cytométrie de flux pour microscopie ou marqueurs de pluripotence des CSEh, tels que Oct-4, SSEA-4, sont nécessaires pour confirmer l&#39;entretien des CSEh dans un état indifférencié dans les conditions de culture nourricier libre.

<table><tbody><tr><td>Substitut de sérum pour l'inactivation génique (KSR)</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal (FBS)</td><td>Réactif</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Réactif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Réactif</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline / Streptomycine </td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Réactif</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Réactif</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Oct-4</td><td>Réactif</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugué à la phyc&amp;#8211;érythrine, IgG3 de souris</td><td>Réactif</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire IgG de lapin conjugué à la FITC</td><td>Réactif</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

de fae au matrigel 2: fractionnement des cseh mefs sur matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) cellules nourricières, comment CSEh passage de plaques MEF pour chargeur de pile plaques sans Matrigel.

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d&#39;immunofluorescence conditions est également démontrée.

De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

Cette vidéo démontre comment cultiver des cellules souches embryonnaires humaines (hESC) sur des cellules nourricières de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ainsi que comment repiquer des hESC à partir de MEF...

Pour maintenir la culture de cellules souches embryonnaires humaines, le milieu de culture doit être renouvelé toutes les 24 heures. Pour ce faire, commencez par une bouteille stock de milieu pour cellules souches embryonnaires conservée à quatre degrés Celsius. Prélevez la quantité de solution nécessaire, généralement d’environ 20 millilitres par six.Plaque de culture et placer cette quantité dans un tube Falcon de 50 millilitres, puis chauffer le tube avec son contenu à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Une fois le milieu réchauffé, ajouter le FGF, qui a été conservé à quatre degrés Celsius, à une concentration finale de 10 nanogrammes par millilitre. Veiller à remettre immédiatement le stock de FGF à quatre degrés Celsius après usage.Veillez à ce que le BFGF dans le milieu de culture des cellules souches humaines soit bien mélangé. Ensuite, retirez tout le milieu de chaque puits en laissant environ 500 microlitres par puits. Puis, ajoutez trois millilitres de milieu frais dans chaque puits d'une plaque à six puits et replacez la plaque dans l'incubateur.Maintenant que nous vous avons montré comment maintenir les cellules souches embryonnaires humaines sur des ONMs, nous allons vous montrer comment les transférer sur de la matrigel. Pour diviser des cellules souches embryonnaires humaines cultivées sur des ONMs et les passer sur de la matrigel, on part d'une plaque de six puits confluentes de cellules souches sur des mes, que l'on peut diviser au ratio d'un à deux ou d'un à trois sur de la matrigel. Plaques de six puits.Cela permettra aux puits de devenir à nouveau confluents quatre à cinq jours après le fractionnement. Lors du fractionnement de cellules souches embryonnaires humaines sur matrigel, utilisez un milieu conditionné au méth pour maintenir la pluripotence. Le milieu conditionné au méth est préparé à l'avance. Cette opération consiste à recueillir quotidiennement, pendant sept jours, le milieu supplémenté avec cinq nanogrammes par millilitre de BFGF provenant d'une culture en croissance de méth ; le milieu pour cellules souches embryonnaires est ensuite utilisé pour remplacer le milieu conditionné au méth retiré.Chaque jour. Les milieux conditionnés au méthanol doivent être utilisés dans un délai d'un mois suivant leur collecte et leur stockage à congélation. La veille de la séparation des cellules souches embryonnaires humaines, nous transférons des aliquots de matrigel dans des tubes EOR du congélateur à moins 20 degrés Celsius vers une température de quatre degrés afin de les décongeler toute la nuit.Un aliquot contient deux milligrammes de matri gel, soit la quantité nécessaire pour une plaque de six puits. Le jour de la division, prenez un flacon de matri gel décongelé.Pour chaque plaque de six puits, mélangez chaque flacon avec six millilitres de milieu D-M-E-M-F 12 froid. N'oubliez pas de maintenir cette solution sur glace. Ajoutez un millilitre de la solution dans chaque puits d'une plaque de six puits.Ensuite, agiter doucement la plaque pour répartir le Matrigel sur la surface et incuber la plaque recouverte de Matrigel à température ambiante pendant au moins une heure avant de diviser les cellules souches embryonnaires humaines. Avant de diviser les cellules souches embryonnaires humaines, laver les cellules souches sur MES une fois avec un XPBS pH 7,4. Ensuite, ajouter un millilitre de collagénase IV chaude à une concentration de un milligramme par millilitre dans chaque puits à diviser, puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes.Après l'incubation, ajoutez un millilitre de milieu pour cellules souches embryonnaires sans BFGF dans chaque puits ; utilisez une pipette de un millilitre pour détacher les cellules souches de la plaque. Rassemblez tout le milieu contenant les agrégats de cellules souches et les MEF dans un tube conique de 15 millilitres. Laissez les gros agrégats cellulaires se déposer pendant cinq minutes afin que les agrégats de cellules souches forment un culot au fond du tube tandis que les MEF restent en suspension dans le surnageant.Une fois que les cellules semblent s'être déposées, éliminer le surnageant et laver les cellules en resuspendant le culot de cellules souches embryonnaires. À l'aide du milieu pour cellules souches embryonnaires sans BFGF, centrifuger ensuite à température ambiante à 200 × g pendant cinq minutes. Pendant que les cellules centrifugent, on peut préparer les plaques de matrigel pour la mise en culture des cellules souches en lavant les plaques avec du D-M-E-M-F 12 à température ambiante à raison d'un millilitre par puits, puis en ajoutant 2,5 millilitres de milieu conditionné supplémenté en 10 nanogrammes par millilitre.BFGF par puits après centrifugation. Resuspendre, suspendre le culot dans un volume approprié de milieu conditionné méth ajouté de 10 nanogrammes par millilitre de BFGF, puis pipeter la suspension cellulaire plusieurs fois vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que les agrégats deviennent uniformes et de petite taille.Ensuite, aliquoter la suspension à raison de 0,5 millilitre par puits sur la plaque de matrigel afin d'obtenir un volume final de trois mils par puits. Pour le matrigel, nous utilisons une densité de colonies plus élevée que lors d'un fractionnement habituel sur maths, une fois les cellules ajoutées. Placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.Pour maintenir les cellules souches embryonnaires humaines dans des conditions de matrigel méth. Le milieu, supplémenté en 10 nanogrammes par millilitre de BFGF, est renouvelé toutes les 24 heures pendant quatre à cinq jours maximum.Les cellules souches embryonnaires humaines sont généralement contaminées par des quantités résiduelles de MEF après le premier fractionnement sur Matrigel ; le deuxième fractionnement, du Matrigel au Matrigel, éliminera complètement toute trace de cellules nourricières contaminant la culture de cellules souches.

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Dans cette vidéo, nous montrons comment notre laboratoire passages couramment HUES humaine lignées cellulaires embryonnaires souches à la trypsine.

HUES repiquage souches embryonnaires humaines lignées cellulaires à la trypsine

Cette vidéo montre comment faire pousser des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sur les cellules de fibroblastes de souris embryonnaires d'alimentation (MEF).

De MEFs à I Matrigel: CSEh repiquage en présence du MEF

Cette vidéo montre comment maintenir la croissance de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dans le chargeur sans cellules conditions et la manière de CSEh passage en continu dans le chargeur sans cellules conditions. Confirmation de CSEh pluripotence grandi dans le chargeur sans cellules par microscopie d'immunofluorescence conditions est également démontrée.

De FAE au Matrigel 3: Le repiquage du Matrigel CSEh sur Matrigel

Cet article se concentrera sur la génération de l'endoderme hépatiques humaines embryonnaires humaines à partir des populations de cellules souches.

Génération robuste des hépatocytes comme des cellules embryonnaires humaines à partir populations de cellules souches

La qualité de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) est dicté par la souche de souris droit tel que CF-1. Pluripotence-soutien MEF et des milieux conditionnés (CM) obtenu à partir de ceux-ci devraient contenir des concentrations optimales de l'activine A, Gremlin et Tgfβ1 nécessaires pour la activine / Nodal et des voies FGF à la co-opératoire de maintenir l'auto-renouvellement et la pluripotence.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.

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Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

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des lignées cellulaires rapporteurs offrent un moyen de visualiser, de suivre et d'isoler des cellules d'intérêt à partir de populations hétérogènes. Cependant, le ciblage génique en utilisant une recombinaison homologue conventionnelle dans les cellules souches embryonnaires humaines est extrêmement inefficace. Ici, nous décrivons le ciblage CNS lieu mésencéphale spécifique Pitx3 facteur de transcription avec EGFP en utilisant doigt de zinc nucléase amélioré recombinaison homologue.

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De FAE au Matrigel 2: Fractionnement des CSEh MEFs sur Matrigel

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