Name: Application dune Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-18T23:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez un test de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C. elegans pour la maladie de Parkinson. Cette méthode permet d'identifier des facteurs génétiques neuroprotecteurs et des mécanismes thérapeutiques potentiels.

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Nous tenons à souligner l&#39;esprit de coopération de tous les membres du laboratoire Caldwell. Mouvements anormaux de recherche dans le laboratoire a été soutenu par la dystonie Bachmann-Strauss &amp; Parkinson Foundation, Royaume-Parkinson Foundation, American Association Maladie de Parkinson, la maladie de Parkinson Association de l&#39;Alabama, la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur le Parkinson, et une recherche de premier cycle

A. Construction plasmide d&#39;expression Deux plasmides sont nécessaires: un pour l&#39;expression tissu-spécifique du gène d&#39;intérêt et un second en tant que marqueur sélectionnable de transformation (bien que le marqueur de plasmide est habituellement disponible au sein de la communauté de la recherche). Experimental plasmidique <ol><li> Sélectionnez un promoteur qui est exprimé dans le type de tissu / cellule d&#39;intérêt, dans ce cas, le transporteur DA (EPEC-1) promoteur est utilisé. Ce plasmide d&#39;expression a été créé comme une passerelle Invitrogen système compatible vecteur de destination (pDEST-DAT-1) pour permettre l&#39;insertion d&#39;un gène d&#39;intérêt en aval du promoteur par clonage par recombinaison 1. </li><li> L&#39;ADNc du gène d&#39;intérêt est amplifié par PCR utilisant des amorces qui contiennent la passerelle att séquence B recombinaison. L&#39;ADNc amplifié est d&#39;abord recombinés dans le vecteur pDONR201 des donateurs pour créer le vecteur d&#39;entrée et ensuite transformé en E. coli souche DH5a. Après la sélection de recombinants succès et mini-prep isolation de l&#39;ADN, le vecteur d&#39;entrée est recombinée dans le pDEST-DAT-1 vecteurs de destination pour créer le plasmide d&#39;expression. Détails sur le clonage par recombinaison sont disponibles à partir du manuel soit Passerelle Invitrogen ou dans Caldwell et al. 5. </li></ol> Marqueurs de sélection plasmidique Un marqueur transgénique plasmide est constitué d&#39;un vecteur par un promoteur qui contrôlent l&#39;expression d&#39;une protéine fluorescente dans un tissu clair. Dans cette procédure particulière, le promoteur unc-54 entraîne l&#39;expression des protéines dans le corps de cerises paroi musculaire (ponctua-54:: cerise). B. Génération de C. elegans transgéniques via micro-injection Voir l&#39;article relatif JoVE: <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833">https://www.jove.com/index/details.stp?ID=833</a> C. Analyse génétique des croix pour la neurodégénérescence DA <ol><li> Worms sont cultivés en utilisant des procédures standard de 6. </li><li> Placer 10 EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP mâles 1, 2 sur une plaque d&#39;accouplement avec 3-4 L4 hermaphrodites transgéniques étape (exprimant EPEC-1: gène X et de ponctua-54:: cerise) . Cela devrait être effectué individuellement pour chacune des trois lignes séparées stables créés. Après deux jours, retirez les mâles. </li><li> Inspectez la génération F1; s&#39;il ya plusieurs descendants mâles, l&#39;accouplement a réussi. </li><li> Clone sur 5 hermaphrodites L4 animaux de chaque croix que présentent à la fois l&#39;EPEC-1:: GFP marqueur fluorescent (hérité du parent mâle) et la ponctua-54:: cerise marqueur fluorescent muscles du corps mur (hérité du parent hermaphrodite). Les animaux clonés doivent être au stade L4 afin de s&#39;assurer qu&#39;ils n&#39;ont pas encore accouplées avec des mâles présents sur le plateau. Permettez-leur de l&#39;auto-cross et produire une descendance F2. </li><li> Animaux F2 produits à l&#39;étape 3 sont clonées sur. Plus précisément, le transfert des animaux ~ 50-10 qui présentent deux marqueurs fluorescents pour leurs propres assiettes individuelles. Écran de la génération F3 pour les plaques d&#39;où 100% de la GFP animaux expriment en DA neurones et certains des animaux sont d&#39;exprimer cerise dans les cellules du corps muscle de la paroi. Ces animaux seront homozygotes pour l&#39;EPEC-1:: α-syn; EPEC-1: gène de la GFP alors stablement transmission du transgène nouvellement créé (gène X). </li></ol> D. Analyse dopaminergiques Neuron <ol><li> Préparer une plaque de frais pour chacune des trois lignes créées ci-dessus, ainsi que l&#39;EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP seule souche. Leur permettre de croître à l&#39;âge adulte. </li><li> Transfert 30-40 adultes transgénique à partir de chaque ligne sur une plaque fraîche. Permettez-leur de jeter des embryons pendant 4 heures à 20 º C. </li><li> Retirez les adultes. Autoriser les embryons à développer pendant 3-4 jours à 20 º C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade L4. </li><li> Choisissez ~ 100 transgénique L4 animaux à une plaque contenant 0,04 mg / ml de 5-fluoro-2&#39;-désoxyuridine (FUDR). Ce nucléotide de développement analogiques des blocs de la prochaine génération par inhibition de la synthèse de l&#39;ADN, empêchant ainsi la descendance de l&#39;animal de laboratoire écrasante 7. Protéger les plaques FUDR de la lumière car il est sensible à la lumière. </li><li> Les animaux adultes seront analysés à plusieurs jours suivant la ponte. Les jours d&#39;analyse appropriées sont déterminées empiriquement. Par exemple, nous avons déterminé que 77%, 87% et 90% de l&#39;EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP animaux présentent dégénéré neurones DA aux jours 6, 7 et 10 de développement post, respectivement. Par conséquent, si nous prévoyons que le transgène d&#39;intérêt pourrait renforcer la neurodégénérescence, nous allons analyser au jour 6 et / ou 7. De même, des transgènes qui pourrait supprimer la neurodégénérescence sera analysée au jour 7 et 10. </li><li> Faire 4 nouveaux pads agarose (contrairement à des plaquettes de gélose microinjection, elles sont utilisées fraîches et ne sont pas autorisés à sécher). Énoncer deux lames de microscope qui ont un morceau de ruban à travers eux; le ruban sert entretoise pour les plaquettes équivalente d&#39;épaisseur. Lay tiersglisser entre eux sur le banc (ils sont positionnés sur trois au courant). Déposer une goutte de agarose fondu sur la lame du centre et rapidement mettre une autre lame sur le dessus de l&#39;agarose, perpendiculaire à et à travers tous les trois diapositives. Faites plusieurs pads supplémentaires, laissant les deux diapositives ensemble jusqu&#39;à ce que le pad est prêt à l&#39;emploi. </li><li> Pour analyser le ver neurones DA, déposer une goutte 6 pi de 3 mM lévamisole (un anesthésique) sur un 22 x 30 mm couvercle en verre. Choisissez 40 animaux adultes (10 supplémentaires au-delà des 30 à être marqué) dans la goutte, puis inverser le couvercle en verre sur le tampon d&#39;agarose. Répétez l&#39;opération pour chacune des autres lignes. </li><li> Score 30 animaux par ligne pour la présence de chaque CEP et ADE neurone à l&#39;aide d&#39;un microscope composé avec épifluorescence et un cube de filtre qui permet la visualisation de FITC ou GFP. Nous utilisons un filtre à gagner à la GFP HyQ cube (technologie Chroma). Enregistrer les données sur la feuille de pointage ci-joint. Animaux de type sauvage conservera fluorescence de la GFP complète dans tous les CEP 4 et 2 neurones ADE. Les animaux individuels présentant une perte de neurones DA sont marqués comme non-WT ou &quot;dégénérer&quot;. De même, la mesure de la dégénérescence peut être marqué par le comptage des neurones perdus au total dans chaque animal ainsi que la population. </li><li> Répétez l&#39;analyse 2 fois plus (30 animaux plus par ligne et par essai). Le nombre total de vers de type sauvage présentant des neurones DA à partir des trois tours des analyses est de moyenne. L&#39;analyse statistique pour la neuroprotection est ensuite effectuée à l&#39;aide de l&#39;étudiant t-test (p &lt;0,05) pour comparer les vers de contrôle (EPEC-1:: α-syn; EPEC-1:: GFP) par des souches qui les gènes candidats sur-expriment dans les neurones DA . </li></ol>

<ol><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li>
<li>Hamamichi, S., Rivas, R. N., Knight, A. L., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis-based+RNAi+screening+identifies+neuroprotective+genes+in+a+Parkinson%E2%80%99s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hypothesis-based RNAi screening identifies neuroprotective genes in a Parkinson’s disease model.</a> PNAS. 105, 728-733 (2008).</li>
<li>Cooper, A. A., Gitler, A. D., Cashikar, A., Haynes, C. M., Hill, K. J., Bhullar, B., Liu, K., Xu, K., Strathearn, K. E., Liu, F., Cao, S., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Marsischky, G., Kolodner, R. D., Labaer, J., Rochet, J. C., Bonini, N. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-synuclein+blocks+ER-golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">alpha-synuclein blocks ER-golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., Bevis, B. J., Shorter, J., Strathearn, K. E., Hamamichi, S., Su, L. J., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Rochet, J. -C., McCaffery, J. M., Barlowe, C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> PNAS. 105, 145-150 (2008).</li>
<li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Genomics%3A+A+Discovery-Based+Laboratory+Course%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course.</a> , John Wiley and Sons. West Sussex, England. (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, J. D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+maintaining+large%2C+aging+populations+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 12, 137-150 (1980).</li>
</ol>

La perte liée à l&#39;âge des neurones à dopamine est une caractéristique clinique de la maladie de Parkinson et a été associée à l&#39;accumulation ou mauvais repliement d&#39;une protéine appelée alpha-synucléine. Ici, nous montrer comment l&#39;étiquette, par l&#39;intermédiaire d&#39;un transgène fluorescentes, les neurones dopaminergiques de C. elegans et imiter la neurodégénérescence observée dans la maladie de Parkinson en coexprimant humaine alpha-synucléine dans ces cellules. Cette vidéo illustre la méthodologie po...

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Verrerie de couverture 20x30 mm</td><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5A</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Planes, 3x1&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo avec fluorescence</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Microscope épifluorescent</td><td>Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td>Modèle E-800</td><td></td></tr><tr><td>Cube de filtres, GFP HYQ</td><td>Bande passante Endow</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

application d&#39;une assay c. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de parkinson gènes

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Les améliorations apportées au diagnostic et au traitement de la maladie de Parkinson (MP) sont tributaires des connaissances sur les facteurs qui rendent la susceptibilité des populations à risque. Dans le processus de tenter d&#39;identifier de nouveaux facteurs génétiques associés à la DP, les scientifiques ont généré de nombreuses listes de gènes candidats, les polymorphismes, et les protéines qui représentent des avancées importantes, mais ces pistes restent mécanistiquement indéfini. Notre travail vise vers un rétrécissement de manière significative ces listes en exploitant les avantages d&#39;un système de modèle animal simple. Bien que les humains ont des milliards de neurones, le nématode Caenorhabditis elegans microscopiques a précisément 302, dont huit seulement de produire la dopamine (DA) dans hemaphrodites. Expression d&#39;un gène humain codant pour la protéine PD-associé, l&#39;alpha-synucléine, dans C. elegans résultats neurones DA de la dose et âge-dépendante neurodégénérescence. Worms exprimer humaine alpha-synucléine dans les neurones DA sont isogéniques et d&#39;exprimer à la fois la GFP et l&#39;alpha-synucléine humaine sous le promoteur du transporteur DA (EPEC-1). La présence de la GFP sert de marqueur pour suivre facilement visualisés neurodégénérescence DA chez ces animaux. Nous avons d&#39;abord démontré que l&#39;alpha-synucléine neurodégénérescence induite DA ont pu être sauvés dans ces animaux par torsinA, une protéine à activité chaperon moléculaire 1. En outre, le candidat PD-liés gènes identifiés dans notre laboratoire au travers de grands efforts de dépistage ARNi en utilisant un dosage repliement alpha-synucléine ont ensuite été sur-exprimée dans les neurones DA C. elegans. Nous avons déterminé que cinq des sept gènes testés représenté modulateurs candidat significatif de PD comme ils sauvé l&#39;alpha-synucléine induite DA neurodégénérescence 2. Par ailleurs, le laboratoire de Lindquist (cette question de Jupiter) a effectué la levure écrans où l&#39;alpha-synucléine-dépendant toxicité est utilisée comme une lecture des gènes qui peuvent augmenter ou supprimer la cytotoxicité. Nous avons ensuite examiné les gènes candidats de la levure dans notre test de C. elegans neurodégénérescence alpha-synucléine-induite et validé avec succès plusieurs de ces trois cibles, 4. Notre méthodologie implique la génération d&#39;un vecteur d&#39;expression de C. elegans DA neurone-spécifique en utilisant le clonage par recombinaison des gènes candidats ADNc sous le contrôle du promoteur EPEC-1. Ces plasmides sont ensuite microinjectés de type sauvage (N2) vers, avec un marqueur de sélection pour la transformation réussie. Plusieurs lignées transgéniques stables produisant la protéine candidate dans les neurones DA sont obtenus indépendamment et ensuite franchi dans la souche alpha-synucléine dégénératives et évalués pour la neurodégénérescence, à la fois l&#39;animal et le niveau des neurones individuels, au cours du vieillissement.

Cette vidéo montre comment utiliser C. elegans afin d&#39;évaluer la neurodégénérescence neurone dopaminergique comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Par ailleurs, cribles génétiques sont utilisés pour identifier les facteurs qui accentuent la dégénérescence ou sont neuroprotecteurs.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

L'amélioration du diagnostic et du traitement de la maladie de Parkinson (MP) dépend de la connaissance des facteurs de susceptibilité qui rendent certaines populations...

Dans le laboratoire Caldwell, aussi connu sous le nom de Worm Shack, nous étudions les mécanismes des maladies neurologiques chez *C. elegans*. Après une longue journée d'expérimentations fructueuses, nous nous récompensons par quelques activités récréatives. Bonjour, je suis Adam Knight, étudiant de premier cycle du laboratoire Caldwell au Département des sciences biologiques de l'Université de l'Alabama.Aujourd'hui, je vais montrer, avec d'autres, comment réaliser un dosage de la dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C. elegans. Je vais croiser une souche de vers présentant une dégénérescence des neurones dopaminergiques avec des souches transgéniques surexprimant des gènes candidats liés à la maladie et les neurones dopaminergiques. Bonjour, je suis Adam Harrington, étudiant diplômé au sein du laboratoire Caldwell.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer les vers transgéniques pour l'analyse des neurones dopaminergiques. Bonjour, je m'appelle Shu Amichi et je suis étudiante diplômante. Ici, je vais vous montrer comment analyser vos neurones dopaminergiques de C. elegans, appelés ceps et aides.En général, les vers exprimant uniquement la GFP dans les neurones dopaminergiques n'exhibent pas de mort cellulaire. Toutefois, en présence de CLE, vous observerez une neurodégénérescence dépendante de l'âge. À l'aide de cet essai, un transgène peut être coexprimé dans les neurones dopaminergiques afin de déterminer s'il peut renforcer ou supprimer la toxicité induite par le CLE. Commençons donc.Avant d'effectuer l'analyse des neurones dopaminergiques, nous devons d'abord croiser les souches GaN appropriées afin de placer huit mouches exprimant à la fois le nucléotide alpha et la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones dopaminergiques dat-1 sur une plaque d'accouplement. Ajoutez maintenant deux stades L4 de femelles transgéniques C. elegans qui présentent une expression spécifique des neurones dopaminergiques de notre gène d'intérêt candidat, ainsi qu'une expression dans les cellules musculaires de la paroi corporelle du marqueur fluorescent sélectionnable DSRed2. Il est important de noter que pour chaque construction transgénique, nous générons trois lignées transgéniques stables.Ce croisement génétique doit donc être effectué individuellement pour chacune des trois lignées stables distinctes créées. Après deux jours, retirez et jetez les mâles après deux à trois jours supplémentaires. Examinez la génération F1.Il existe plusieurs descendants mâles et le croisement a été couronné de succès. Ensuite, transférez individuellement sur de nouvelles boîtes Petri cinq animaux au stade L4 d’Aphrodite provenant de chaque croisement, présentant à la fois le marqueur fluorescent GFP hérité du parent mâle et le marqueur rouge DS, marqueur fluorescent des muscles pariétaux, hérité du parent hamadi. Les animaux transférés doivent être au stade L4 afin de s’assurer qu’ils n’ont pas encore subi la mitose.Avec les mâles présents sur la boîte, laissez les animaux s'autoféconder pendant trois à quatre jours afin de produire une descendance F2. Maintenant, éliminez la descendance F2 pour réaliser cette étape. Transférez cinq à dix animaux présentant les deux marqueurs cent sur des boîtes individuelles.Ensuite, sélectionner la génération F3 pour les plaques dans lesquelles cent pour cent des animaux expriment la GFP dans les neurones dopaminergiques et dans lesquelles certains animaux expriment le marqueur fluorescent DS-Red2 dans les cellules musculaires de la paroi corporelle. Ces animaux seront homozygotes pour les gènes de l'alpha-synucléine et de la GFP et transmettront également de façon stable le transgène nouvellement créé. Une fois le criblage terminé, nous sommes prêts à effectuer l'analyse des neurones dopaminergiques.Pour commencer l'analyse des neurones, préparez une plaque fraîche avec les trois animaux F identifiés à l'étape précédente. Préparez une plaque pour chacune des trois lignées transgéniques. En outre, dressez la souche exprimant uniquement l'alpha-synucléine GFP comme témoin, et laissez les vers grandir jusqu'à l'âge adulte.Une fois que les vers ont atteint l'âge adulte, transférez 30 à 40 animaux transgéniques de chaque lignée sur une plaque fraîche. Laissez-les pondre des œufs pendant cinq heures à 20 degrés Celsius. Au bout de cinq heures, retirez-les et jetez-les.Les adultes laissent les embryons se développer pendant trois à quatre jours à 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4. Ensuite, sélectionnez environ cent animaux transgéniques au stade L4 et placez-les sur une boîte contenant 0,04 milligramme par millilitre de cinq-fluoro-2-désoxyuridine.Cet analogue de nucléotide empêche le développement de la génération suivante par inhibition de la synthèse de l'ADN. Étant donné que les boîtes de FDUR sont sensibles à la lumière, protégez-les en les gardant couvertes et entièrement enveloppées. Préparez un grand tampon pour l'analyse des vers.Ils sont utilisés frais et ne doivent pas être laissés sécher. Préparez deux lames de microscope ayant chacune un morceau de ruban adhésif disposé longitudinalement. Le ruban sert d'espacement pour obtenir des tampons d'épaisseur équivalente.Placez une troisième lame entre elles sur le banc. Elles sont positionnées. Trois côte à côte.Déposer une goutte d'arus fondu sur le côté central et poser rapidement une autre lame par-dessus l'agros perpendiculairement aux deux premières et traversant les trois lames. Répéter afin de fabriquer plusieurs tampons supplémentaires, en nombre suffisant pour le nombre d'échantillons à analyser. Une fois les tampons auger prêts, déposer une goutte de six microlitres d’anesthésique à trois millimolaire, 11 mile saw, sur un couvre-objet de 22 par 30 millimètres.Prélevez 40 animaux adultes dans la goutte, puis retournez le couvre-objet sur le tampon agros. Répétez l'opération pour chacune des autres lignées. Évaluez 30 animaux par lignée pour la présence de chaque CEP et d'un neurone D.À l’aide d’un microscope composé doté d’une fluorescence épiscopique et d’un cube de filtres permettant la visualisation de la FITC ou de la GFP, nous utiliserons un cube de filtres endo G-F-P-H-Y-Q pour enregistrer les données sur une feuille de notation. Les animaux de type sauvage conservent une GFP complète dans les leçons des quatre neurones CEP et des deux neurones A DE. Les animaux individuels présentant une perte des neurones D sont notés comme étant de type sauvage connu ou en dégénérescence.Ces neurones sont enregistrés comme LG ou perte de GFP. De même, l'ampleur de la dégénérescence peut être évaluée en comptant le nombre total de neurones perdus chez chaque animal, ainsi que la population répétant l'analyse deux fois supplémentaires. En utilisant 30 animaux supplémentaires par lignée par essai.Le nombre total de vers présentant des neurones dopaminergiques de type sauvage, issus des trois cycles d'analyse, est moyenné. Une analyse statistique concernant la neuroprotection est ensuite réalisée à l'aide du test t de Student, avec une valeur P inférieure à 0,05. Pour comparer les vers témoins avec les souches surexprimant des gènes candidats dans les neurones dopaminergiques, réalisez cette analyse à différents jours suivant la mise en place de la bande d'œufs ; les jours appropriés pour l'analyse sont déterminés empiriquement.Par exemple, nous avons déterminé que 77 %, 87 % et 90 % des animaux exprimant alpha CLE associé à GFP présentent des neurones dopaminergiques dégénérés respectivement au sixième, septième et dixième jour après le développement. Par conséquent, si nous prévoyons que le transgène d'intérêt pourrait accélérer la neurodégénérescence, nous effectuerons l'analyse au sixième jour. De même, les transgènes susceptibles d'inhiber la neurodégénérescence seront analysés aux septième et dixième jours.Nous venons de vous montrer comment réaliser un dosage de neurodégénérescence dopaminergique chez l'élégance marine. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir de : un, utiliser un marqueur approprié pour la sélection lors des croisements génétiques ; deux, utiliser des mâles sains et des HEDIS L4 pour les croisements.Et trois, assurez-vous de marquer soigneusement et de manière constante les neurones CEP et DE. Cette procédure vous permettra d'analyser rapidement les facteurs génétiques susceptibles d'accentuer ou de supprimer la neurodégénérescence induite par l'alpha alpha CLE. Voilà, c'est tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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