Application d'une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Dans le laboratoire Caldwell, aussi connu sous le nom de Worm Shack, nous étudions les mécanismes des maladies neurologiques chez *C. elegans*. Après une longue journée d'expérimentation fructueuse, nous nous récompensons par quelques activités récréatives. Bonjour, je suis Adam Knight, étudiant de premier cycle du laboratoire Calwell, du Département des sciences biologiques de l'Université de l'Alabama.

Aujourd'hui, moi et d'autres chercheurs allons montrer comment réaliser un test de dégénérescence des neurones dopaminergiques chez C. elegans. Je vais croiser une souche de vers présentant une neurodégénérescence dopaminergique avec des souches transgéniques surexprimant des gènes candidats liés à la maladie et des neurones dopaminergiques. Bonjour, je suis Adam Harrington, étudiant diplômé au sein du laboratoire Caldwell.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment préparer les vers transgéniques pour l'analyse des neurones dopaminergiques. Bonjour, je suis Shu Amichi et je suis étudiante diplômante. Ici, je vais vous montrer comment analyser vos neurones dopaminergiques de C. elegans, appelés ceps et aides.

En général, les vers exprimant uniquement la GFP dans les neurones dopaminergiques n'exhibent pas de mort cellulaire. Toutefois, en présence de CLE, vous observerez une neurodégénérescence dépendante de l'âge. À l'aide de ce test, un transgène peut être coexprimé dans les neurones dopaminergiques afin de déterminer s'il peut renforcer ou supprimer la toxicité induite par le CLE. Commençons donc.

Avant d'effectuer l'analyse des neurones dopaminergiques, nous devons d'abord croiser les souches GaN appropriées afin de placer huit mouches exprimant à la fois le nucléoprotéine alphas et la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones dopaminergiques dat-1 sur une plaque d'accouplement. Ajoutez maintenant deux hermaphrodites transgéniques de stade L4 qui présentent une expression spécifique des neurones dopaminergiques de notre gène d'intérêt candidat, ainsi qu'une expression dans les cellules musculaires de la paroi corporelle du marqueur fluorescent sélectionnable DS-red2. Il est important de noter que pour chaque construction transgénique, nous générons trois lignées transgéniques stables.

Ce croisement génétique doit donc être effectué individuellement pour chacune des trois lignées stables distinctes créées. Après deux jours, retirez et jetez les mâles après un délai supplémentaire de deux à trois jours. Examinez la génération F1.

Il existe plusieurs descendants mâles et le croisement a été couronné de succès. Ensuite, transférez individuellement sur de nouvelles boîtes Petri cinq animaux au stade L4 d'Aphrodite de chaque croisement qui présentent à la fois le marqueur fluorescent GFP hérité du parent mâle et le marqueur rouge DS de fluorescence des muscles pariétaux hérité du parent hamadi. Les animaux transférés doivent être au stade L4 afin de s'assurer qu'ils n'ont pas encore subi la mitose.

Avec les animaux mâles présents sur la boîte, laisser les animaux s'autoféconder pendant trois à quatre jours afin de produire une descendance F2. Maintenant, éliminer la descendance F2 pour cela. Transférer cinq à dix animaux présentant les deux marqueurs cent sur des boîtes individuelles séparées.

Ensuite, sélectionner la génération F3 sur des boîtes où cent pour cent des animaux expriment la GFP dans les neurones dopaminergiques et où certains animaux expriment le marqueur fluorescent DS-Red2 dans les cellules musculaires de la paroi corporelle. Ces animaux seront homozygotes pour les gènes de l'alpha-synucléine et de la GFP et transmettront également de façon stable le transgène nouvellement créé. Une fois le criblage terminé, nous sommes prêts à effectuer l'analyse des neurones dopaminergiques.

Pour commencer l'analyse des neurones, préparez une plaque fraîche avec les trois animaux identifiés à l'étape précédente. Préparez une plaque pour chacune des trois lignées transgéniques. En outre, dressez la souche exprimant uniquement l'alpha-synucléine GFP comme témoin, et laissez les vers grandir jusqu'à l'âge adulte.

Une fois que les vers ont atteint l'âge adulte, transférez 30 à 40 animaux transgéniques de chaque lignée sur une plaque fraîche. Laissez-les pondre des œufs pendant cinq heures à 20 degrés Celsius. Après cinq heures, retirez-les et jetez-les.

Les adultes permettent aux embryons de se développer pendant trois à quatre jours à 20 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade L4. Ensuite, sélectionnez environ cent animaux transgéniques au stade L4 sur une boîte contenant 0,04 milligramme par millilitre de 5-fluoro-2-désoxyuridine.

Cet analogue de nucléotide empêche le développement de la génération suivante par inhibition de la synthèse de l'ADN. Étant donné que les boîtes de FDUR sont sensibles à la lumière, protégez-les en les gardant couvertes et entièrement enveloppées. Préparez un gros tampon pour l'analyse des vers.

Ils sont utilisés frais et ne doivent pas être laissés sécher. Préparez deux lames de microscope sur lesquelles une bande de ruban adhésif est placée dans le sens de la longueur. Ce ruban sert d'espacement pour obtenir des tampons d'épaisseur équivalente.

Placez une troisième lame entre elles sur le banc. Elles sont positionnées. Trois côte à côte.

Déposez une goutte d'arus fondu sur le côté central et posez rapidement une autre lame par-dessus l'agros perpendiculairement à deux et traversant les trois lames. Répétez afin de réaliser plusieurs coussinets supplémentaires, autant que nécessaire pour le nombre d'échantillons à analyser. Une fois les coussinets d'auger prêts, déposez une goutte de six microlitres d'anesthésique à trois millimolaire, 11 miles, sur un couvre-objet de 22 par 30 millimètres.

Prélevez 40 animaux adultes dans la goutte, puis retournez le couvre-objet sur le tampon d'agarose. Répétez l'opération pour chacune des autres lignées. Évaluez 30 animaux par lignée pour la présence de chaque CEP et d'un neurone D.

À l’aide d’un microscope composé doté d’une fluorescence épi dans un cube de filtres permettant la visualisation de la FITC ou de la GFP, nous utiliserons un cube de filtres endo G-F-P-H-Y-Q pour enregistrer les données sur une feuille de notation. Les animaux de type sauvage conservent une GFP complète dans les leçons des quatre neurones CEP et des deux neurones A DE. Les animaux individuels présentant une perte des neurones D sont notés comme étant de type sauvage connu ou en dégénérescence.

Ces neurones sont enregistrés comme LG ou perte de GFP. De même, l'ampleur de la dégénérescence peut être évaluée en comptant le nombre total de neurones perdus chez chaque animal, ainsi que la population répétant l'analyse deux fois supplémentaires. En utilisant 30 animaux supplémentaires par lignée par essai.

Le nombre total de vers présentant des neurones dopaminergiques de type sauvage, issus des trois cycles d'analyse, est moyenné. Une analyse statistique de la neuroprotection est ensuite réalisée à l'aide du test t de Student, avec une valeur P inférieure à 0,05. Pour comparer les vers témoins avec les souches surexprimant des gènes candidats dans les neurones dopaminergiques, effectuez cette analyse à différents jours suivant la mise en place de la bande d'œufs, les jours appropriés d'analyse étant déterminés empiriquement.

Par exemple, nous avons déterminé que 77 %, 87 % et 90 % des animaux exprimant alpha CLE et GFP présentent des neurones dopaminergiques dégénérés respectivement au sixième, septième et dixième jour après le développement. Par conséquent, si nous prévoyons que le transgène d'intérêt pourrait accélérer la neurodégénérescence, nous effectuerons l'analyse au sixième jour. De même, les transgènes susceptibles d'inhiber la neurodégénérescence seront analysés aux septième et dixième jours.

Nous venons de vous montrer comment réaliser un dosage de neurodégénérescence dopaminergique chez l'élégance marine. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se souvenir de choisir, premièrement, un marqueur approprié pour la sélection lors des croisements génétiques. Deuxièmement, d'utiliser des mâles sains et des HEDIS L4 pour les croisements.

Et trois, assurez-vous de noter soigneusement et de manière constante les neurones CEP et DE. Cette procédure vous permettra d'analyser rapidement les facteurs génétiques susceptibles d'accentuer ou de supprimer la neurodégénérescence induite par le CLE alpha alpha. Voilà, c'est tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.