Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

Bonjour, je suis Cody Locke du laboratoire Caldwell du département des sciences biologiques de l’Université de l’Alabama. Je m’appelle Kyle Lee et je vais vous montrer comment préparer les vers pour les dosages d’exposition aux glucides et aux PTZ. Je m’appelle Bernard Tu et je vais vous montrer comment effectuer des dosages de glucides.

Je m’appelle Kaylin Berry et je suis responsable des vidéos d’élégance de la mer. Dans cette présentation, je vais raconter cette présentation et démontrer le test d’exposition PTZ. Aujourd’hui, mes collègues et moi allons montrer comment caractériser les mutants de transmission synaptique avec un modèle d’élégance marine de l’épilepsie après exposition à PTZ et Alde carb avec une série de souches mutantes représentatives.

Alors commençons. Kyle Lee va commencer aujourd’hui en montrant la préparation des dosages de glucides ALD le premier jour de la procédure. Assurez-vous qu’au moins 30 jeunes vers adultes de chaque génotype et de chaque réplique seront disponibles pour les tests de glucides ALD le deuxième jour.

Il est préférable qu’un expérimentateur sélectionne 50 L ou plus de vers à quatre stades sur des plaques NGM fraîches sans fongicide reposant sur e coli OP 50 comme source de nourriture. Faites pousser les vers pendant 12 à 24 heures à une température constante et permissive. 20 degrés Celsius à 22 degrés Celsius sont préférables, bien que 25 degrés Celsius soient acceptables.

Le deuxième jour, préparez une solution mère de 100 millimolaires d’Al Decarb et d’éthanol à 70 % et étalez la quantité appropriée d’Al Decarb sur des plaques NGM. Nous utilisons systématiquement 0,5 millimolaire al Decarb en plaquant 37,5 microlitres de 100 millimoles de carburateur alde sur des plaques de Petri non ventilées de 60 millimètres avec 7,5 millilitres en g. Laissez les plaques de carburateur alde sécher pendant environ 30 à 60 minutes à température ambiante.

Il n’est pas nécessaire de casser les couvercles une fois que les plaques sont sèches. Ajoutez des volumes constants d’e coli au centre de chaque plaque de glucides ALDE et séchez pendant encore 30 à 60 minutes. À température ambiante, nous ajoutons généralement 25 microlitres d’e coli OP 50.

Ce volume d’OP 50 crée une pelouse alimentaire de taille suffisante pour garder les vers dans un petit endroit du centre de l’assiette sans surpeuplement. Une fois que la pelouse alimentaire est sèche, procédez aux dosages de glucides alba. En raison de la nature subjective des dosages de carburateur ALD, il est fortement recommandé que les expériences soient effectuées à l’aveugle.

Pour ce faire. Un collègue de l’expérimentateur principal réétiquetait les plaques d’origine contenant les vers à analyser, ou le collègue pouvait transférer les vers des plaques d’origine vers des plaques de carburateur de chiffrement immédiatement avant de démarrer une minuterie. Maintenant que les plaques ont été siées, le bore ABO va procéder à l’analyse pour commencer l’analyse, compter le nombre de vers paralysés.

Il existe deux approches principales pour définir la paralysie aiguë induite par l’al décarb. La première approche définit la paralysie par l’arrêt du pompage pharyngé. Dans cette note vidéo, une structure sombre qui est située dans la lumière du pharynx du ver à droite de l’écran.

Cette structure s’appelle le broyeur et se contracte rythmiquement par un mécanisme cholinergique. La locomotion du ver dans cette vidéo a été considérablement ralentie par l’exposition à l’Al Decarb. Pourtant, le broyeur pharyngé de ce ver est toujours clairement en mouvement.

Par conséquent, ce ver n’est pas paralysé par une définition d’arrêt du pompage. On devrait voir dans cette vidéo que le broyeur pharyngé situé à droite de l’écran ne se contracte pas avec l’arrêt du pompage comme définition de travail de la paralysie induite par al Decarb. Ce ver doit être considéré comme paralysé.

Cependant, comme le ver de la vidéo précédente, ce ver présente de légers mouvements de recherche de nourriture d’un côté à l’autre. Bien que sa locomotion ait été altérée par Al Decarb, ces mouvements empêcheraient un expérimentateur de considérer ce ver comme paralysé par la deuxième approche pour définir la paralysie induite par Al Decarb, l’immobilité de tout le corps et l’absence de réponse au toucher. La deuxième approche pour définir la paralysie induite par le décarboxylation consiste à pousser systématiquement chaque ver avec un fil de platine et à vérifier une réponse.

Si les mouvements du corps ne peuvent pas être détectés à l’œil nu, notre approche préférée consiste à pousser nos vers deux fois sur la tête et deux fois sur la queue toutes les 30 minutes pour un total de trois heures. Comme vous devriez le voir, le ver dans cette vidéo ne bouge manifestement pas son corps. Néanmoins, parce que ce ver répond à l’aiguillon en bougeant clairement sa queue, nous n’appelons pas ce ver paralysé.

Selon la deuxième définition de la paralysie induite par l’al décarb. Comme le ver de la vidéo précédente, ce ver ne bouge pas visiblement son corps et nécessite donc un test d’aiguillonnage. Pourtant, contrairement au ver de la vidéo précédente, ce ver ne répond pas clairement à l’encouragement.

Par conséquent, ce ver est paralysé par la deuxième définition de la paralysie induite par l’al décarboxyl. Bien que la différence entre paralysé et non paralysé par l’alde carb puisse être subtile, les expérimentateurs devraient être en mesure d’identifier des altérations substantielles et une transmission synaptique en observant simplement un grand nombre de vers représentatifs exposés à l’Al Decarb immédiatement après avoir été prélevés sur des plaques d’Al Decarb. Les vers de type sauvage sont toujours mobiles.

Dans cette vidéo. On verra les mêmes vers sauvages de la vidéo précédente après une heure d’exposition à Al Decarb. Notez que les vers ralentissent dans une certaine mesure, mais qu’ils se déplacent toujours clairement.

Contrairement aux vers de type sauvage, les mutants Tomasin One de cette vidéo sont soit complètement immobilisés, soit à peine mobiles après une heure d’exposition. Ce résultat est cohérent avec le fait que les mutants de la tomasine un ont une sécrétion excessive d’acétylcholine en raison d’une incapacité à réguler négativement la libération de neurotransmetteurs aux jonctions neuromusculaires, l’excès d’acétylcholine et les fentes synaptiques aux jonctions neuromusculaires combinées à l’inhibition de la dégradation de l’acétylcholine, Bial Decarb rend les mutants de la tomasine un hypersensibles, bien que cela ne soit pas montré ici, des résultats similaires ont été postulés pour découler des tests d’alde carb avec perte de fonction des allèles de sur 43, qui code pour le C elegance ortho log de la protéine kinase dépendante du calcium cal Moulin deux. Cette vidéo montre 25 mutants, qui sont déficients en transmission GABAergique inhibitrice.

Après une heure d’exposition à alde carb, similaire aux mutants tomasin one et M 43, ces mutants présentent des déficiences locomotrices significatives induites par alde carb et semblent être plus affectés que les vers de type sauvage exposés à al Decarb pendant une durée identique. Ce résultat est cohérent avec le fait que les mutants M 25 ont surstimulé les muscles de la paroi corporelle en raison d’une combinaison d’exposition à l’al Decarb et d’une transmission GABAergique réduite, conduisant à un rapport de transmission excitateur/inhibiteur plus élevé au niveau des EL CL, des jonctions neuromusculaires et à une paralysie ultérieure. Pourtant, parce que tomasin un sur 43 et sur 25 mutants présentent des sensibilités similaires à Al Decarb à ce stade.

Bien qu’il existe différentes causes de surstimulation des muscles de la paroi corporelle, un expérimentateur ne pouvait pas connaître le mécanisme sous-jacent de l’hypersensibilité sans connaître d’abord l’identité des mutations causales. Pour cette vidéo, nous sommes revenus aux mêmes vers de type sauvage d’une vidéo précédente après trois heures d’exposition à l’al Decarb à ce point final de notre test de carburateur ALD, on devrait clairement voir que ces vers, bien qu’ils soient de type sauvage, sont soit complètement immobilisés, soit à peine mobiles. Ces vers sont maintenant phénotypiquement similaires aux mutants TOM one et M 25 montrés une heure après l’exposition à alde carb, probablement parce que la transmission cholinergique excitatrice a atteint des niveaux comparables à ceux des vers de type sauvage, les mutants Synap Bren one restent considérablement mobiles à trois heures d’exposition à alde carb.

Ce résultat est cohérent avec les mutants Synaptive Bren, qui n’ont pas de niveaux normaux de sécrétion de neurotransmetteurs, ayant moins de stimulation cholinergique au niveau des muscles de la paroi corporelle que les vers de type sauvage des bois après des niveaux identiques d’exposition aux glucides alde à ce moment. Point sur quatre mutants, qui sont spécifiquement déficients dans la transmission cholinergique, devraient avoir des sensibilités similaires à Al Decarb que les mutants Synaptive Bren one. À l’inverse, les mutants hypersensibles Tomasin 1 et O 25 restent paralysés, un peu comme les vers de type sauvage.

Il convient de noter que certains vers, en particulier ceux qui résistent à Al Decarb, peuvent tenter de ramper hors de l’assiette. Dans ce cas, l’expérimentateur peut répandre une quantité constante d’acide palmitique, une barrière physique à la locomotion des vers. Autour des plaques d’Al Decarb, nous épandons 25 microlitres de 10 milligrammes d’acide palmitique par millilitre d’éthanol.

Cela complète le paradigme d’exposition à l’Al Decarb. Maintenant, je vais démontrer le paradigme d’exposition au Penta Lean Terazol. Kaylin Berry nous aidera avec les tests PTZ.

La préparation des vers pour les dosages PTZ est essentiellement la même que la préparation des vers pour les dosages alde carb. Les seules différences significatives entre les deux tests sont les suivantes. Nous utilisons du DDH deux O comme solvant PTZ au lieu de 70 % d’éthanol.

De plus, comme nous plaquons souvent de plus grands volumes de PTZ que le carburateur ALDE, nous laissons les plaques sécher pendant au moins une heure avant d’ajouter OP 50. L’acide palmitique peut également être utilisé avec le PTZ. De plus, il est important de noter que le PTZ est beaucoup moins stable que l’alde carb et doit être stocké à moins 20 degrés Celsius.

Pour commencer l’analyse, comptez le nombre de vers épileptiques convulsés toutes les 30 minutes pour un total d’une heure. Il est préférable de noter le nombre de vers avec différents types de convulsions dans des catégories distinctes telles que les convulsions du corps entier, les convulsions antérieures, que nous appelons la combinaison de convulsions antérieures avec la paralysie musculaire de la paroi corporelle, que nous appelons paralysie tonico-clonique ou paralysie du corps entier, que nous appelons tonique tonique. L’activité convulsive, comme on le voit avec le ver de droite, suit souvent des convulsions tonico-cloniques, comme on le voit avec le ver de terre sur le tonique de gauche.

Une activité semblable à une crise pourrait simplement résulter d’une fatigue musculaire à la suite de convulsions tonico-cloniques répétitives. Cependant, nos données non publiées indiquent que certains vers peuvent devenir toniques sur PTZ d’une manière similaire à la paralysie induite par al decarb sans avoir été auparavant tonico-cloniques. Ici, nous montrons un ver mutant représentatif de la transmission synaptique rampant en l’absence d’antagoniste du récepteur GABA PTZA et d’inducteur de crise commun dans divers modèles animaux de crises et d’épilepsie.

Notez que la pointe ou le nez du ver se balance d’un côté à l’autre pendant la recherche de nourriture. Dans cette vidéo, nous montrons un autre ver de la même souche mutante de transmission synaptique utilisée dans la vidéo précédente. Notez que ce ver, qui est en présence de 2,5 milligrammes de PTZ par millilitre d’eau, continue principalement à bouger sa tête d’un côté à l’autre pendant qu’il cherche de la nourriture.

Pourtant, ce ver arrête parfois de chercher de la nourriture d’un côté à l’autre et pousse plutôt de manière répétitive son antérieur vers l’avant. Enfin, on devrait voir un ver qui porte la même mutation que les vers des deux vidéos précédentes en présence de 10 milligrammes PTZ par millilitre d’eau. Notez que ce ver a diminué en cherchant de la nourriture d’un côté à l’autre et qu’il pousse son antérieur vers l’avant avec une fréquence et une intensité plus élevées qu’avec la plus faible concentration de PTZ.

Ces résultats démontrent la dépendance doseuse du PTZ, que nous observons avec tous les mutants de transmission synaptique sensibles au PTZ. Il est important de noter que l’exposition au PTZ n’est pas suffisante pour induire des convulsions épileptiques chez les vers de type sauvage. De même, nous avons tenté mais non observé des convulsions épileptiques induites par PTZ chez des vers présentant des déficits spécifiques de transmission cholinergique tels que sur quatre ou des vers avec une transmission cholinergique excessive comme la tomasine un.

Par conséquent, il devrait être possible de caractériser davantage les mutants de transmission synaptique présentant une résistance à l’alde carb à partir de déficits de la fonction synaptique générale ou de déficits spécifiques de la transmission cholinergique en fonction de leurs sensibilités relatives à la PTZ. Peut-être étonnamment, une forte réduction de la fonction du mutant ONC 25, qui n’a pas d’expression détectable de GABA dans l’élégance C. Les motoneurones inhibiteurs ne présentent pas de convulsions lumineuses épileptiques spontanées comme on le voit dans cette vidéo.

Un mutant ONC 25 sur 10 milligrammes de PTZ par millilitre d’eau. Cependant, présente des convulsions tonico-cloniques robustes, bien que non montrées antérieures, seules des convulsions avec un certain mouvement ont précédé les convulsions tonico-cloniques associées à ONC 25 et ont imité les convulsions des mutants synap Bren one. Par conséquent, un expérimentateur ne devrait pas supposer que tous les mutants inhibiteurs du GABA présenteront des convulsions tonico-cloniques ou une activité de type convulsive tonique étroitement associée en présence de PTZ, en particulier compte tenu de la probabilité d’obtenir des allèles mutants hypomorphes.

Maintenant que nous avons démontré une hypersensibilité à alde carb et à PTZ par des mutants GABA inhibiteurs, mais seulement une hypersensibilité à alde carb et une sensibilité normale à PTZ par des mutants manquant de régulation négative de la transmission cholinergique. On pourrait se demander à quoi ressemblent les mutants de perte de fonction UNC 43 sur PTZ puisqu’ils sont également hypersensibles au carburateur Alda comme nos autres mutants de transmission synaptique sur 43 mutants ne présentent pas de convulsions épileptiques évidentes en l’absence de PTZ, bien que ces mutants aient de rares contractions non répétitives, mais toujours spontanées, de tout le corps après une exposition à 10 milligrammes de PTZ par millilitre d’eau sur 43, Des mutants de perte de fonction présentent des convulsions corporelles complètes, robustes, répétitives et dose-dépendantes. À l’heure actuelle, ces résultats sont ambigus mais semblent indiquer que le on 43 ne doit pas avoir un rôle spécifique dans la transmission inhibitrice du GABAergic ou un rôle uniquement dans la régulation négative de la libération de neurotransmetteurs.

Dans le système nerveux C elegance, nous venons de vous montrer comment caractériser les mutants de transmission synaptique CL elgan avec des stimulants neuronaux complémentaires, alde carb, un inhibiteur de la cholinestérase et un antagoniste du récepteur GABA PTZA. Lorsque vous suivez l’un ou l’autre paradigme pharmacologique complémentaire, rappelez-vous que le degré de sensibilité à un stimulant neuronal ne peut pas prédire le degré de sensibilité à l’autre stimulant neuronal L’utilisation de dosages alde carb devrait aider à distinguer les mutants inhibiteurs GABA, qui dirigent Bob sur PTZ, mais sont hypersensibles à Alde carb des mutants généraux déficients en fonction synaptique, qui dirigent également Bob sur PTZ, mais résistent au carburateur alde. De plus, il faut se rendre compte que les mutants inhibiteurs du GABA dirigent Bob sur le PTZ tandis que les vers qui n’ont pas de régulation négative de la transmission cholinergique apparaissent de type sauvage sur le PTZ.

Par conséquent, le test PTZ pourrait également être utilisé pour distinguer ces classes de mutants de transmission synaptiques, qui sont toutes deux hypersensibles à l’Alde carb. En résumé, une approche complémentaire avec des dosages PTZ et Alde carb devrait permettre à un expérimentateur de caractériser les mutants élégants de transmission synaptique C d’une manière qui est impossible avec l’un ou l’autre médicament seul. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.