Name: Le dépistage de lagrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez la technique SDD-AGE pour détecter les polymères amyloïdes dans les cellules. Cette méthode semi-dénaturante permet de séparer les agrégats protéiques résistants au SDS et de les analyser à grande échelle.

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Nous remercions Simon Alberti pour l&#39;assistance à l&#39;élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM25874), du Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (pour SL), et un National Science Foundation bourse de formation pré-doctorale (pour HR).

<html> Partie 1: Préparer le gel <ol><li> Montez le plateau de coulée de gel. L&#39;équipement standard pour l&#39;électrophorèse l&#39;ADN horizontale peut être utilisé. Pour un grand nombre d&#39;échantillons, nous préparons un 20 cm x 24 cm dalle avec un maximum de quatre 50-bien peignes. Assurez-vous que la dalle n&#39;a pas les égratignures, car ils peuvent déformer l&#39;image blot. </li><li> Créer une solution de 1,5% d&#39;agarose (moyen ou élevé de gel solidité, faible OEE) de TAE 1X. Le volume devrait être suffisant pour submerger entièrement les dents du peigne - vous voulez charger l&#39;échantillon autant que possible pour maximiser la détection. Micro-ondes le mélange jusqu&#39;à l&#39;agarose est complètement dissous. </li><li> Ajouter rapidement SDS à 0,1% à partir d&#39;un stock de 10%. Faire tourbillonner pour mélanger. Si certains d&#39;agarose se solidifie au cours de cette étape, redissolvent utilisant une plaque chauffante et être prudent pour éviter l&#39;ébullition. </li><li> Verser la solution dans le bac prépondérante. Utilisez un peigne à ratisser les bulles, car ils pourraient interférer avec le transfert tard. </li><li> Après un gel a pris, retirer peignes et placer le gel dans le réservoir de gel. Immerger complètement le gel dans 1X TAE contenant 0,1% SDS. </li></ol> Partie 2: Préparation des échantillons <ol><li> Pour analyse à haut débit des lysats levure, nous commençons avec 2 ml cultures cultivées pendant une nuit sous agitation rapide de 96 puits blocs. Dans ce cas, chaque culture est surexprimant une protéine d&#39;intérêt. Lors de l&#39;analyse des protéines de faible abondance, les volumes de culture plus large doit être utilisé </li><li> Récolte des cellules par centrifugation à 2000 RCF pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Resuspendre les cellules dans l&#39;eau et centrifuger à nouveau. </li><li> Remettre en suspension dans 1 ml de solution sphéroplastes. Incuber pendant environ 30 min à 30 ° C (vous pouvez confirmer l&#39;efficacité sphéroplastes par microscopie). </li><li> Centrifuger à 800 RCF pendant 5 min à température ambiante. Supprimer complètement le surnageant. </li><li> Resuspendre sphéroplastes granulés dans 100 ml de tampon de lyse. </li><li> Couvrir le bloc avec du ruban adhésif et le vortex à haute vitesse pendant 2 min. </li><li> Culot cellulaire débris à 4000 RCF pendant 2 min. </li><li> Retirer délicatement le surnageant dans un nouveau conteneur, par exemple, une plaque de 96 puits PCR. </li><li> Si désiré, déterminer la concentration en protéines des lysats. </li><li> Ajouter le tampon d&#39;échantillon 4X pour les échantillons contenant de générer lysats 1X tampon de l&#39;échantillon. Incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Charge de gel. Si désiré, économiser la moitié du volume d&#39;échantillon et de la faire bouillir pour analyse SDS-PAGE. Afin de surveiller l&#39;ampleur du transfert par la suite, notamment un pré-SDS-PAGE coloré marqueur. De plus, un marqueur de poids moléculaire composé de protéines très élevé (par exemple, le poulet pectoral extrait) peut être utilisé pour estimer la taille des complexes résolus. </li><li> Exécutez à basse tension (≤ 3 la longueur du gel V / cm) jusqu&#39;à ce que le front atteigne ~ 1 cm de l&#39;extrémité du gel. Cela va prendre plusieurs heures. Il est important que le gel rester cool, sinon la diffusion de protéines de faible poids moléculaire (par exemple, les monomères) peut limiter leur détection. </li></ol> Partie 3: Transfert <ol><li> Coupez un morceau de nitrocellulose aux mêmes dimensions que le gel. </li><li> Coupez 20 morceaux de GB004 et GB002 8 morceaux de papier buvard, pour les mêmes dimensions que le gel. Couper une pièce supplémentaire de GB004 pour être utilisé comme une mèche, il font environ 20 centimètres plus large que le gel. </li><li> Plonger la nitrocellulose, mèche, et 4 morceaux de GB002 en 1X SCT. </li><li> Dans un récipient en plastique, d&#39;assembler une pile de papiers comme suit: 20 morceaux de GB004 sécher, puis 4 morceaux de GB002 sec, puis un morceau de pré-humide GB002. Poser la nitrocellulose en haut de cette pile. </li><li> Rincer le gel sur le plateau de coulée brièvement dans l&#39;eau pour enlever l&#39;excès tampon. Puis, soigneusement commencer à glisser le gel hors du bac sur la pile. Tout en faisant glisser le gel hors du bac, éteindre la membrane avec le SCT, si nécessaire. Le tampon supplémentaire permet d&#39;éviter les bulles de devenir coincé sous le gel. Une pipette de transfert fonctionne bien dans ce but. </li><li> Après le gel a été déplacé à la pile, vérifiez soigneusement pour les bulles. Si elles existent, soulevez le bord du gel et de réappliquer tampon jusqu&#39;à ce que les bulles peuvent être élaborées. </li><li> Mettez les trois autres pré-mouillé GB002 morceaux sur le dessus du gel. Assurer un contact complet entre toutes les couches de roulement par une pipette fermement sur le haut de la pile. </li><li> Flanc la pile de transfert avec deux plateaux élevés contenant du SCT. Drapé de la mèche pré-humide dans la pile de sorte que chaque extrémité de la mèche est immergé dans le SCT. </li><li> Couvrir la pile transfert assemblé avec un plateau en plastique supplémentaires portant le poids supplémentaire (par exemple, une bouteille de 500 ml d&#39;eau). </li><li> Autoriser le transfert de procéder à un minimum de trois heures, ou jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Après le transfert, la membrane peut être traitée par la norme Western blot. </li></ol> Solution sphéroplastes 1,2 M de D-sorbitol 0,5 mM MgCl 2 Tris 20 mM, pH 7,5 50 mM BME (ajouter frais) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (ajouter frais) coration: underline; &quot;Lysis Buffer&gt; 100 mM de Tris 7,5 NaCl 50 mM BME 10 mM (ajouter frais) inhibiteurs de protéase (ajouter frais) Tampon d&#39;échantillon 4X 2X TAE 20% de glycérol 8% de SDS bleu de bromophénol à la préférence

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE a été d&#39;abord rapporté par Kryndushkin et al. 1, pour étudier SDS-résistants complexes de la [PSI +] prion chez la levure, et a depuis trouvé une utilisation largement répandue étudier à la fois à prions et les non-prion agrégats 2-9. Toutefois, le transfert des protéines à une électrophorèse membrane suite à un gel d&#39;agarose est problématique, et peut aboutir à une image déformée blot 5. De plus, la technique submergée électrotransfert les plus couramment utilisés introduit des limitations pratiques à la taille du gel et donc le nombre d&#39;échantillons qui peuvent être traitées. Nous avons résolu ces problèmes en employant la baisse transfert capillaire 10, une procédure simple qui utilise une pile de sèche buvards de transférer les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose. Transfert capillaire évite la déformation et permet des gels importants pour être traités facilement. Il ya quelques choses à considérer avant d&#39;utiliser DDS-AGE. Pour les échantillons bruts (par exemple, des lysats), immunodétection des protéines spécifiques est nécessaire. SDD-âge n&#39;a pas totalement dénaturer les complexes protéines d&#39;intérêt, alors la protéine (s) à détecter doit porter une étiquette épitopique en dehors de la région amyloïdogénique. Lysats peuvent généralement être préparés comme ils le seraient pour une normale de SDS-PAGE, avec deux différences importantes. Premièrement, les soins accrue doivent être prises pour prévenir la dégradation par protéolyse. Les conditions partiellement dénaturantes utilisées ici ne sont pas suffisantes pour inactiver les protéases, et peut également fabriquer des protéines cibles plus sensibles à la protéolyse. Utilisez un cocktail inhibiteur de la protéase complète au moins deux fois la concentration recommandée. Deuxièmement, le chauffage des échantillons devrait être évitée. Si un contrôle tous les monomères négatif est souhaitée, par exemple pour confirmer que haut poids moléculaire des espèces ne sont pas dues à des modifications covalentes, une incubation de 10 minutes à 95 ° C peut être utilisé, ce qui va restaurer la plupart amyloïdes à la protéine monomérique.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d'inhibiteurs de protéases Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose Hybond-C extra</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>Papier buvard GB004</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>Papier buvard GB002 (3MM Chr)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

le dépistage de l&#39;agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant détergent-agarose

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

L&#39;agrégation amyloïde est associée à de nombreuses pathologies mauvais repliement des protéines et des sous-tend les propriétés infectieuses des prions, qui sont auto-conformation des protéines templating qui sont pensés pour avoir des rôles bénéfiques dans les organismes inférieurs. Amyloïdes ont été notoirement difficile à étudier en raison de leur insolubilité et de l&#39;hétérogénéité structurelle. Cependant, la résolution de polymères amyloïde basée sur la taille et de l&#39;insolubilité de détergent a été rendue possible par semi-dénaturantes Détergent-électrophorèse sur gel (SDD-âge). Cette technique est de trouver l&#39;utilisation généralisée pour la détection et la caractérisation des variantes amyloïdes conformation. Ici, nous démontrons une adaptation de cette technique qui facilite son utilisation dans les applications à grande échelle, tels que des écrans pour les prions roman et d&#39;autres protéines amyloïdogénique. La nouvelle SDD-ÂGE méthode utilise le transfert capillaire pour une plus grande fiabilité et facilité d&#39;utilisation, et permet à tout gel de taille à être logé. Ainsi, un grand nombre d&#39;échantillons, préparés à partir de cellules ou de protéines purifiées, peuvent être traitées simultanément la présence de SDS-insolubles de protéines conformères marqués.

DDS-AGE est une technique utile pour la détection et la caractérisation de l&#39;amyloïde comme les polymères dans les cellules. Ici nous démontrons une adaptation qui rend cette technique prêtent à grande échelle des applications.

Le dépistage de l&#39;agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose

L'agrégation amyloïde est associée à de nombreuses pathologies liées au repliement incorrect des protéines et sous-tend les propriétés infectieuses des prions, qui sont...

Bonjour, je suis Randall Hoffman, étudiant diplômé du laboratoire de Susan Linus au département de biologie du MIT. Aujourd'hui, je vais vous présenter la technique de rétroélectrophorèse sur gel en présence de détergent semi-dénaturant, ou SDD AGE. Notre laboratoire utilise cette méthode pour dépister les prions et d'autres protéines allégéniques.Notre version de l'âge SDD est simple et fiable, et peut être adaptée pour traiter un nombre quelconque d'échantillons. Les amyloïdes sont exceptionnellement résistants à la dénaturation par le SDS, ce qui permet de les séparer des autres protéines à l'aide de la SDDH. Toutefois, les données obtenues par SDDH ne peuvent pas à elles seules être utilisées pour confirmer qu'une structure est un amyloïde.Pour ce faire, vous devez utiliser d'autres techniques. Dans cette optique, permettez-moi de vous montrer. Le S-D-D-H-S-D-D-H peut être réalisé à l'aide d'un équipement standard pour l'électrophorèse horizontale de l'ADN.Tout d'abord, vous devez assembler le bac de coulée du gel. La taille de l'appareil dépendra du nombre d'échantillons que vous possédez. Pour un grand nombre d'échantillons, nous utilisons une plaque de 20 sur 24 centimètres et jusqu'à quatre peignes de 50 puits.Pour préparer le gel, vous aurez besoin d'agarose à faible EEO de force moyenne ou élevée, d'un tampon 1X TAE et d'une solution mère de SDS à 10 %. Préparez une solution d'agarose à 1,5 % et du tampon 1X TAE. Vous voudrez fabriquer un gel aussi épais que possible afin de pouvoir charger le plus d'échantillon possible et maximiser la détection. Chauffez le mélange au micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissoute.Ajoutez rapidement le stock de SDS 100 X à 0,1 % et tourbillonnez pour homogénéiser. Si un dépôt d'agarose se forme pendant cette étape, réchauffez et dissolvez-le sur un bloc chauffant. Prenez garde de ne pas laisser bouillir.Après avoir ajouté le SDS, la solution risquant de mousser facilement, versez-la dans le bac de coulée tant qu'elle est encore chaude. Utilisez ensuite un peigne pour éliminer les bulles d'air qui pourraient ultérieurement gêner le transfert sur gel. Une fois que le gel est complètement refroidi et solidifié, retirez soigneusement les peignes et placez le gel dans la cuve.Immergez complètement le gel dans un tampon XTAE contenant 0,1 % de SDS. Vous êtes maintenant prêt à charger vos échantillons. Les échantillons protéiques utilisés dans le SDDH sont préparés de la même manière que dans un SDS-PAGE, à deux exceptions importantes près.Tout d'abord, vous devez éviter de chauffer les échantillons, ce qui pourrait dénaturer les agrégats en monomères protéiques. Deuxièmement, veillez à prévenir la dégradation des protéines. Étant donné que les conditions dénaturantes utilisées ici ne sont pas suffisantes pour inactiver toutes les protéases, nous recommandons d'utiliser une concentration d'au moins deux fois supérieure à la concentration recommandée d'un cocktail complet d'inhibiteurs de protéases.Dans cette démonstration, nous utiliserons des lysats de cellules de levure qui surexpriment une protéine d'intérêt particulière. Nous utilisons généralement deux millilitres de culture. Les cultures sont cultivées dans des blocs de 96 puits disponibles chez VWR, mais lors de l'analyse de protéines peu abondantes, des volumes de culture plus importants doivent être utilisés.Récupérez les cellules par centrifugation de la culture à 2000 RCF pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, retirez le surnageant et lavez les cellules en les resuspendant dans de l'eau, puis centrifugez à nouveau. Après la deuxième centrifugation, retirez le surnage&ntilde;ant et resuspendez les cellules dans une solution de plaquage fraîche. Les enzymes présentes dans la solution digèrent les parois cellulaires, ce qui permet de lyser efficacement les cellules avec un petit volume de tampon de lyse. Incubez pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.Centrifuger les cellules plastiques supplémentaires cette fois à 800 RCF pendant cinq minutes. Éliminer complètement le surnageant et resuspendre chaque culot dans 100 microlitres de tampon de lyse. Ensuite, recouvrir le bloc avec du ruban adhésif et vortexer à grande vitesse pendant deux minutes.Cela permet à tous les plastiques de sphère de LY P d’éliminer les débris cellulaires à 4 000 ×g pendant deux minutes. Transférez soigneusement le surnageant sur une plaque PCR de 96 puits.Typiquement, nous analysons des centaines d'échantillons à la fois dans notre laboratoire, c'est pourquoi nous utilisons un système de manipulation de liquides. Si désiré, déterminez la concentration en protéines des lysats. Ensuite, ajoutez un tampon d'échantillonnage 4 x aux échantillons afin d'obtenir des lysats contenant un tampon d'échantillonnage 1 x, puis incubez pendant cinq minutes à température ambiante.Chargez maintenant les échantillons dans le gel. Si souhaité, conservez la moitié des échantillons pour une analyse par électrophorèse SDS-PAGE. Chargez également des marqueurs de poids moléculaire, y compris des marqueurs pré-étiquetés et un marqueur de très haut poids moléculaire, tel que l'extrait de fibrine de poulet.Si nécessaire, il est important de maintenir le gel au frais afin d'éviter la diffusion des protéines de faible masse moléculaire ; vous pouvez donc choisir de faire la migration dans une chambre froide. Faites migrer le gel à basse tension, inférieure à trois volts par centimètre de longueur du gel. Faites migrer le gel pendant plusieurs heures jusqu'à ce que le front de migration atteigne environ un centimètre de l'extrémité du gel.Étant donné que l'amyloïde n'est pas dénaturé par le SDS à 2 % à température ambiante, il restera intact tandis que d'autres complexes, notamment la plupart des agrégats non amyloïdes, se dissocieront en présence de SDS à 2 %. Ainsi, la majorité des protéines seront sous forme monomérique et migreront rapidement à travers le gel. En revanche, les amyloïdes de haut poids moléculaire résistants au SDS migreront plus lentement.À ce stade, le gel sera prêt pour le transfert. Bien que plusieurs méthodes de transfert puissent être utilisées, nous obtenons les meilleurs résultats avec le transfert capillaire. Étant donné que le transfert capillaire peut s'adapter à n'importe quelle taille de gel, il est pratique d'analyser des centaines d'échantillons par transfert capillaire.Une pile de papiers buvards secs sert à faire passer le tampon à travers le gel, déposant ainsi les protéines sur une membrane de nitrocellulose placée entre les papiers et le gel. Vous devrez découper un morceau de nitrocellulose, comme du High Bond C, supplémentaire, aux mêmes dimensions que le gel. Vous devrez également découper 20 morceaux de papier buvard GBO oh quatre et huit morceaux de papier buvard GBO oh deux aux mêmes dimensions que le gel.Le GB oh four est très épais et absorbant. Le GBO oh deux est en revanche beaucoup plus mince et possède une texture plus fine, ce qui assure un contact plus uniforme avec la membrane. Découpez un morceau supplémentaire de GBO oh quatre à utiliser comme mèche, en le rendant environ 20 centimètres plus large que le gel immergé.Le WIC UL nitreux et quatre morceaux de GBO oh deux et un XTBS dans un contenant en plastique assemblent une pile de feuilles comme suit : 20 morceaux de GBO oh quatre secs. Puis quatre morceaux de GBO oh deux secs. Puis un morceau de GBO oh deux préhumidifié.Placez la nitrocellulose sur le dessus de ce bloc. Rincez brièvement le gel sur le plateau de coulée à l’eau pour éliminer l’excès de tampon de migration. Ensuite, commencez soigneusement à faire glisser le gel hors du plateau sur le bloc, tout en ajoutant du TBS sur le gel au fur et à mesure qu’il quitte le plateau vers la membrane, si nécessaire.Le tampon supplémentaire aide à empêcher les bulles de s'immobiliser dans le gel. La pipette de transfert convient bien à cet usage une fois que le gel a été entièrement déplacé vers l'empilement. Vérifiez soigneusement la présence de bulles, s'il y en a. Soulevez le bord du gel et réappliquez du tampon jusqu’à ce que les bulles soient éliminées. Placez les trois morceaux restants de GBO oh deux préhumidifiés sur le dessus du gel. Assurez un contact complet entre toutes les couches en roulant fermement une pipette sur le dessus de l’empilement.Encadrez la pile de transfert avec deux plateaux surélevés contenant du TBS ; étendez le tampon pré-humidifié sur la pile de manière à ce que chaque extrémité du tampon soit immergée. Recouvrez la pile de transfert assemblée avec un plateau en plastique supplémentaire portant un poids supplémentaire, comme une bouteille d'eau de 500 ml. Le tampon capillera le tampon des plateaux et les papiers de transfert secs capillèreront le tampon à travers le gel sur plusieurs heures.Cela déposera les protéines sur la membrane ; laissez le transfert s'effectuer pendant au moins trois heures ou toute la nuit. Une fois le transfert capillaire terminé, la membrane peut être traitée selon la méthode classique du western blot. Voici un exemple typique de transfert de protéines surexprimées dans une souche de levure qui prédispose certaines protéines à former des amyloïdes.Vous pouvez clairement voir que certains de nos candidats forment très bien des espèces amyloïdes ou de haut poids moléculaire résistantes au SDS, comme celles illustrées ici et ici. D'autres, en revanche, ne forment pas d'agrégats et sont entièrement monomériques, comme celles-ci et celles-ci. De plus, vous pouvez observer que la taille des polymères amyloïdes varie selon la protéine, ce que vous pouvez constater dans ces deux bandes.Nous venons de vous présenter une méthode simple pour analyser les agrégats de haut poids moléculaire et insolubles, tels que les amyloïdes de prions candidats. Nous espérons que vous avez apprécié cette présentation et que cette technique vous sera utile dans l'étude des protéines amyloïdes immunogènes. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos recherches.

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Nous décrivons une technique pour la préparation de clarifier humaine homogénats corticaux, la séparation des protéines par SDS-PAGE, la récupération d'antigène et immunoblot avec un anticorps dirigé contre le peptide Aß. En utilisant ce protocole, nous avons constamment de détecter Aßi monomère et multimère dans le tissu cortical des humains à la pathologie d'Alzheimer.

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Ce protocole décrit l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien protéotoxique. Suivre cette procédure permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques in vivo dans différentes souches bactériennes et/ou entre les traitements.

Extraction et visualisation d’agrégats protéiques après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique

Nous décrivons ici un système de levure reconstituant la γ-sécrétase humaine. Ce système permet d’identifier et d’étudier les mutations affectant l’activité et de cribler les inhibiteurs de la γ-sécrétase (GSI). En utilisant les propriétés de perte de fonction des mutants familiaux de la maladie d’Alzheimer, il est possible de dépister les modulateurs de la γ-sécrétase (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modèles de la maladie d’Alzheimer pour cribler les gènes, les mutations et les produits chimiques affectant la production de bêta-amyloïde par la γ-sécrétase

Cette étude présente des méthodes expérimentales pour caractériser biochimiquement le GFAP et ses mutations pathogènes, en se concentrant sur l’assemblage, l’agrégation et la modification post-traductionnelle des filaments. Des protéines GFAP de haute pureté ont été analysées, révélant des informations sur les mécanismes de la maladie d’Alexander qui pourraient fournir un cadre pour étudier les cibles thérapeutiques potentielles et comprendre les mutations GFAP et les troubles associés.

Approches expérimentales pour l’analyse biochimique de la protéine acide fibrillaire gliale et de ses variantes associées à la maladie

Découvrez la technique SDD-AGE pour détecter les polymères amyloïdes dans les cellules. Cette méthode semi-dénaturante permet de séparer les agrégats protéiques résistants au SDS et de les analyser à grande échelle.

Le dépistage de l'agrégation amyloïde par les semi-électrophorèse sur gel dénaturant Détergent-Agarose

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