Une technique rapide pour la visualisation de Live cellules de levure immobilisées
9 novembre 2006
Une technique rapide pour la visualisation de la croissance des cellules de la levure immobilisée, ici appliqué à des journalistes fluorescentes au niveau des loci d'accouplement silencieuse HML et HMR
Le but de l’expérience est de pouvoir suivre une population de cellules uniques au microscope afin que je puisse voir comment les états épigénétiques changent, à quelle fréquence les états épigènes changent avec chacun, avec chaque division successive des cellules, prendre une longue couverture, prendre environ sept microlitres de cellules, Placez-le sur la longue lamelle et utilisez un COM, une plaque de support synthétique. Prenez une lame de rasoir puis faites des entailles dans l’agar. Prenez donc un bloc de gélose, soulevez-le et placez-le sur les cellules.
D’accord, pour des expériences à court terme, jusqu’à trois heures. Cela en soi est très bien. Les cellules seront immobilisées pour des expériences à plus long terme, j’ajoute du milieu liquide li sur le dessus du tampon gélosaire, puis je mets une lame de verre sur le tout.
Les médias nous fourniront comme un sceau entre les deux. Le glissement sert uniquement à empêcher l’évaporation par le haut du bloc de gélose. Ainsi, avec cette configuration, le bloc d’œufs restera humide et les cellules continueront à se diviser jusqu’à huit, au moins jusqu’à huit heures.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente une technique rapide permettant de visualiser des cellules de levure immobilisées, en se concentrant sur des marqueurs fluorescents aux loci d'appariement silencieux HML et HMR. La méthode permet d'observer les changements d'état épigénétique au cours de la division cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Épigénétique
- Physiologie microbienne
Contexte
- Comprendre les modifications épigénétiques dans les cellules de levure est essentiel pour obtenir des informations sur le comportement cellulaire.
- Les capteurs fluorescents permettent de visualiser efficacement les loci génétiques.
- Les techniques d'immobilisation sont essentielles pour l'observation prolongée au microscope.
- La levure constitue un organisme modèle pour l'étude des processus génétiques et épigénétiques.
Objectif de l'étude
- Visualiser la croissance et la division de cellules de levure immobilisées.
- Surveiller les changements d'états épigénétiques au cours de la division cellulaire.
- Développer une méthode facilitant les expériences à court et à long terme.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un long lame couvre-objet contenant un volume spécifique de cellules de levure.
- Utilisation de plaques de milieu synthétique pour la croissance cellulaire.
- Immobilisation des cellules à l'aide de blocs d'agar pour l'observation.
- Application d'un milieu liquide pour des durées expérimentales prolongées.
Résultats principaux
- Visualisation réussie de la croissance et de la division des cellules de levure.
- Observation de changements d'état épigénétique au cours de divisions successives.
- Démonstration de l'efficacité de la technique d'immobilisation.
- Apercus sur la dynamique des changements épigénétiques chez la levure.
Conclusions
- La technique fournit une méthode fiable pour étudier le comportement des cellules de levure.
- Les capteurs fluorescents sont efficaces pour surveiller les loci génétiques.
- Cette approche peut améliorer la compréhension de la régulation épigénétique dans les cellules.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette technique permet une visualisation en temps réel de la dynamique épigénétique chez la levure, soutenant la validation de cibles dans la découverte de médicaments épigénétiques. En suivant les changements d'état stochastiques aux loci d'appariement silencieux, elle fournit des données quantitatives pour l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux composés modifiant la chromatine. La compatibilité de la méthode avec la microscopie en prise de vue différée jusqu'à dix heures permet d'évaluer la stabilité épigénétique au fil des générations, renforçant la fiabilité prédictive des modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation des mécanismes d'héritage épigénétique au niveau de loci génétiques définis.
- Valeur opérationnelle : Fournit une plateforme souple pour valider les cibles impliquées dans le silence chromatinien.
- Valeur prédictive : Permet d'évaluer les effets de la modulation des cibles sur les fréquences de basculement de l'état épigénétique.
Tests et développement de tests
- Prêt-à-l’usage du test : Crée des populations de levures immobilisées adaptées au criblage de composés avec des détections fluorescentes.
- Résultat quantitatif : Permet la mesure des taux de commutation épigénétique comme paramètre fonctionnel du test.
- Extensibilité : Compatible avec des formats multi-puits grâce à l’immobilisation sur coussin d’agar pour des tests parallèles de conditions multiples.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise l'instabilité épigénétique observée dans les cancers et les troubles du développement.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les mécanismes épigénétiques de la levure et les voies de régulation de la chromatine chez les mammifères.
- Progrès ajusté au risque : Permet une détection précoce des risques associés aux cibles épigénétiques en quantifiant la stabilité de leur état.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce, où la validation de cibles épigénétiques nécessite l'observation directe de changements d'état dans des cellules vivantes.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les régulateurs épigénétiques grâce à la visualisation en temps réel de locus spécifiques.
- Criblage : Génère des préparations cellulaires standardisées et reproductibles pour le criblage de bibliothèques de composés.
- Analyse : Fournit des données quantitatives sur la fréquence de commutation afin de comparer les effets des composés sur la stabilité épigénétique.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les mécanismes de silençage chez la levure et la régulation de la chromatine d'ordre supérieur dans des modèles de maladies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme d'immobilisation réutilisable pour cibler plusieurs régulations épigénétiques et réaliser des études en cours de temps.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles épigénétiques grâce à l'observation directe.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité par l'immobilisation normalisée sur coussin d'agar et le scellement en milieu liquide.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en quantifiant le bruit épigénétique et les effets de la modulation de la cible.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des modificateurs épigénétiques en se basant sur les données de fréquence de commutation.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en génétique des levures et en microscopie à fluorescence.
- Dépend de la disponibilité de milieux synthétiques et d'agarose pour la préparation des lames.
- Implique une standardisation de la densité cellulaire et des dimensions des blocs d'agar lors des différentes expériences.
- Implique des adaptations selon les souches de levures et les systèmes de rapporteurs fluorescents utilisés.
- Est limité par le contrôle de l'évaporation dans les dispositifs ne comportant pas de surcouche de milieu liquide lors des expériences prolongées.
