Double Mont entier hybridation in situ d'embryons de poulet début

Cette procédure commence par un traitement de fixation, de méthanol et de protéinase K des embryons, suivi d’une nuit d’incubation avec une sonde creuser ou creuser et sonder. Deux embryons d’isothiocyanate de fluorescéine ou ZI sont incubés avec l’anticorps dig après une réaction de couleur avec la phosphatase alcaline dig. L’activité est inactivée et les embryons sont incubés.

Avec FSE, la réaction de couleur de l’anticorps est réalisée avec Zi et les embryons sont fixés. Bonjour, je suis Delphine du laboratoire de Rick Finnel au Center for Environmental and Genomic Medicine de l’Université Texas a et m à Houston. Aujourd’hui, nous allons vous montrer la procédure pour effectuer deux hybridations de colorants situ dans l’embryon de poussin.

Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour analyser les effets des médicaments antiépileptiques sur les gènes gastriques et neuraux. Pour effectuer une hybridation in situ sur des embryons de poussin, ouvrez d’abord un œuf en tapotant la coquille avec une pince et en retirant des morceaux de la coquille. Retirez l’albumine épaisse à l’aide d’une pince et inclinez le sac vitellin avec une pince grossière de manière à ce que l’embryon soit tourné vers le haut à l’aide de ciseaux fins.

Découpez un carré de sac vitellin autour de l’embryon. Retirez l’embryon du jaune à l’aide d’une cuillère et placez-le dans un plat contenant de la glace. Froid dey PBS sous un microscope de dissection Retirez soigneusement les membranes et l’embryon et transférez l’embryon dans une boîte fraîche contenant de la glace.

À froid, maintenez l’embryon avec une pince et aspirez le PBS dans la hotte. Remplacez-le par de l’aldéhyde paraforme à 4 % dans le PBS et laissez l’embryon se fixer à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Une fois les embryons fixés, aspirez la solution fixatrice et éliminez-la correctement en tant que déchet chimique.

Remplissez le plat de PBS glacé à l’aide d’une micro-aiguille capillaire à extrémité émoussée ou d’un couteau de microdissection pour perforer la tête et les cavités cardiaques. Pour éviter le piégeage de la sonde. Placez les embryons dans du DEP CPBS contenant 0,1 % de marbre 20, puis déshydratez les embryons dans un lavage de série de méthanol pendant 10 minutes chacun dans 25 % 50 % 75 % et 100 % de méthanol dans du PBT.

Répétez le lavage 100 % méthanol. Les embryons peuvent maintenant être conservés à moins 20 degrés Celsius dans du méthanol. Dans des flacons à scintillation en verre de 20 millilitres.

Pour réaliser l’hybridation in situ, il faudra d’abord réhydrater les embryons. Pour ce faire, lavez les embryons 10 minutes chacun dans du méthanol à 75 %50 % et 25 % dans du PBT. Enfin, lavez deux fois pendant 10 minutes chacune.

Dans le PBT, retirer la solution PBT des flacons et la remplacer par une solution de protéinase K de cinq microgrammes par millilitre. Trois millilitres par flacon. Roulez doucement le flacon pour vous assurer que tout le contenu est exposé à la solution de protéinase K.

Laisser dans la solution de protéinase K pendant une à cinq minutes selon le stade embryonnaire. Pendant ce temps, préparez une solution fixatrice glacée à l’aide d’une pipette sans ARN, retirez la solution de protéinase K et ajoutez deux millilitres de solution fixatrice. Placez immédiatement le flacon sur de la glace pendant exactement 20 minutes.

Ensuite, lavez les embryons à température ambiante sur un mutateur. Effectuez deux lavages de 10 minutes en PBT suivis d’un lavage de 10 minutes en tampon d’hybridation à 50 % en PBT. Ensuite, lavez-les une fois dans un tampon d’hybridation à 100 %, incubez les embryons dans deux millilitres de tampon d’hybridation pendant quatre à cinq heures.

À 65 degrés Celsius. Les embryons sont maintenant prêts à être hybridés avec des sondes creuses et la synthèse par sonde couplée fitzy est décrite dans le matériel de support. La sonde censée donner un signal fort doit être synthétisée avec des nucléotides contenant des FSE, tandis que les sondes plus faibles doivent être synthétisées avec des nucléotides contenant des dig

Pré-avertir les sondes dans le tampon d’hybridation à l’aide d’un flacon de deux millilitres. Retirez le tampon d’hybridation des embryons et remplacez rapidement le tampon d’hybridation par la solution de sonde. Il est important de ne pas laisser les embryons incuber à sec pendant 16 heures à 65 degrés Celsius.

Après l’étape d’hybridation de la sonde, remplacez la solution de la sonde par un tampon d’hybridation. Effectuez deux lavages de 30 minutes à 65 degrés Celsius, puis lavez pendant 15 minutes dans un mélange individuel d’hybridation, de tampon et de tampon d’acide maléique à nouveau à 65 degrés Celsius. Après cette étape, vous n’avez plus besoin d’utiliser des conditions sans ARN.

Vous êtes maintenant prêt à effectuer la réaction de couleur dig suivie de la réaction de couleur Fitz. Pour effectuer d’abord l’hybridation des anticorps et la réaction de couleur, lavez les embryons deux fois pendant 20 minutes chacun dans un tampon d’acide maléique. Laver ensuite pendant une heure dans 2 % VBR dans un tampon d’acide maléique.

Enfin, observez pendant cinq heures dans le tampon de blocage Diluez l’anticorps un à 2000 dans le tampon de blocage et incubez les embryons dans cette solution sur un mutateur pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, effectuez trois lavages de 10 minutes dans un tampon d’acide maléique, suivis de trois lavages d’une heure dans un tampon d’acide maléique. Lavez deux fois pendant 20 minutes chacune.

Dans NTMT, ajoutez 200 microlitres de substrat N-B-T-B-C-I-P à 10 millilitres. Les NTMT sont immédiatement retirés du flacon contenant l’embryon et les remplacent par un à deux millilitres. Tampon N-B-T-B-C-I-P placé dans l’obscurité.

Surveillez la réaction de la couleur après 20 minutes et à intervalles de 20 minutes par la suite. Lorsque la couleur bleue s’est développée de manière appropriée, lavez les embryons dans du PBS pendant 10 minutes. Remplacez ensuite le PBS par 4 % d’aldéhyde paraforme dans le PBS.

Fixer toute la nuit à quatre degrés Celsius. Transférez l’embryon dans un nouveau flacon d’installation syn lavage au PBT deux fois pendant 10 minutes chacune, suivi de deux lavages de 10 minutes dans un tampon d’acide maléique. Incuber les embryons dans un tampon d’acide maléique pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius.

Il est maintenant temps d’effectuer la deuxième incubation d’anticorps et la réaction de couleur. Afin de détecter notre deuxième ajustement de la sonde marquée, lavez les embryons deux fois pendant 10 minutes chacun dans un tampon d’acide maléique. Une heure dans 2 %BBR dans un tampon d’acide maléique.

Ensuite, cinq heures dans un tampon de blocage, diluez l’anticorps anti-FTSE couplé à la phosphatase alcaline de un à 500 dans un tampon de blocage et incubez les embryons dans cette solution pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, trois lavages de 10 minutes dans un tampon d’acide maléique, suivis de trois lavages d’une heure dans un tampon d’acide maléique. Ensuite, lavez deux fois pendant 20 minutes chacune.

Dans Tris HCL, préparez cinq millilitres de solution de travail de rouge vectoriel dans tris HCL selon le protocole du fabricant. Retirez immédiatement le triss HCL du flacon et remplacez-le par le tampon rouge vectoriel. Placez les flacons dans l’obscurité.

Surveillez la réaction de la couleur après 30 minutes et à intervalles de 30 minutes par la suite, une fois que la couleur rouge s’est développée, transférez les embryons au PBS. Vous êtes enfin prêt à réparer et à traiter les embryons. Transférez-les dans un plat de fixation contenant 4 % de paraforme, d’aldéhyde et fixez-les pendant 20 minutes à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Lavez deux fois en PBS 10 minutes par lavage pour le traitement de la photographie. Transférez les embryons à 20 % de glycérol dans du PBS. Cela rendra les embryons translucides pour le traitement de la section de la cire.

Transférez les embryons dans le PBS, lavez-les deux fois pendant 10 minutes chacun, déshydratez-les en une série de méthanol pendant 10 minutes chacun, remplacez le méthanol par du propanol et incubez pendant trois minutes. Retirez le propanol et remplacez-le par 1 2 3 4 tetra hydro nap filine pendant 20 minutes, suivi de histo clear, deux lavages d’une heure chacun. Remplacer par un mélange individuel de histo clear et de cire et incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure.

Remplacez cette solution par de la cire et procédez à l’histologie. Cet embryon est étiqueté avec un digo oxygène en chaussettes, deux sondes en bleu et une sonde delta fitzy qui apparaît en rouge. La première réaction de couleur révèle le motif d’expression des chaussettes. Deux.

Un marqueur de la plaque neurale développé en laboratoire de niveau Dr. Robin badge sox deux cellules positives apparaissent bleues après réaction avec N-B-T-B-C-I-P. Le même embryon est ensuite traité pour la deuxième réaction de couleur, qui révèle le modèle d’expression de delta one. Un marqueur de la plaque segmentaire développé dans le laboratoire du Dr Domingo Enrique Delta : les cellules positives apparaissent rouges, après réaction avec le vecteur, rouge.

Cet embryon est marqué avec un digo en PAC, une sonde six en bleu et une sonde SHH en rouge. La première réaction de couleur révèle le modèle d’expression de PAC six, un marqueur pour les plis neuraux et les somites en développement développé dans le laboratoire du Dr Martin Goulding Pac. Six cellules positives apparaissent bleues après réaction avec N-B-T-B-C-I-P.

La deuxième réaction de couleur révèle le modèle d’expression du marqueur SHHA pour le Noor et la ligne médiane ventrale du tube neural développé dans le laboratoire du Dr Cliff Tabban. Les cellules SHH positives apparaissent en rouge, après réaction avec le vecteur rouge. Nous venons de vous montrer comment effectuer la coloration et l’hybridation chez le poulet.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des solutions traitées en profondeur C ainsi que de l’autoclave, des pfas et du vi stérile. Afin de minimiser le contact avec les ARN, les étapes trois à cinq se déroulent. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.