Name: Réagréger cultures Thymus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Apprenez à préparer des cultures réagrégées de thymus traitées au 2-dGuo pour étudier la différenciation des lymphocytes T et les interactions cellulaires. Cette méthode génère des sous-populations CD4+ et CD8+.

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Pour plus d&#39;informations sur la préparation des cultures de thymus reggregate s&#39;il vous plaît visitez <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocoles Springer</a> .

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

réagréger cultures thymus

Reaggregate Thymus Cultures

Dans le thymus, les CD4 + thymocytes immatures 8 exprimant hasard réarrangés récepteur des cellules T α-et b-gènes de la chaîne subissent les épreuves de sélection positive et négative sur leur capacité à reconnaître complexe majeur d&#39;histocompatibilité self-peptide/major (CMH) exprimées par thymique Les cellules stromales. Dans l&#39;analyse in vivo du rôle des cellules stromales thymiques lors de la sélection intrathymique est rendue difficile par la complexité du microenvironnement cellulaire thymique dans le thymus adulte état stable, et par le manque de stratégies appropriées visant à manipuler l&#39;expression des gènes, en particulier thymique compartiments stromal. Nous avons montré que le microenvironnement thymique peut être facilement manipulées in vitro par l&#39;utilisation de cultures d&#39;organes réagréger thymus, qui permettent la préparation de trois dimensions lobes de thymus de définir les cellules stromales et lymphoïdes. Bien que d&#39;autres systèmes in vitro en charge certains aspects du développement des cellules T, réagréger culture d&#39;organe thymus reste le seul système in vitro en mesure de soutenir efficacement CMH de classe I et II à médiation épreuves de sélection thymocytes, et peut donc être utilisé comme un outil efficace pour étudier la régulation cellulaire et moléculaire de la sélection positive et négative dans le thymus.

Dans cette vidéo, la préparation de la 2-dGuo traités réagréger cultures thymus est démontrée.

Réagréger cultures Thymus

Les cellules stromales au sein des tissus lymphoïdes sont organisées en structures tridimensionnelles qui constituent un échafaudage censé contrôler la migration et...

Bonjour, je suis Andrea White et je travaille dans le laboratoire de Graham Anderson et Eric Jenkinson au Centre MRC pour la Régulation Immunitaire de l'Université de Birmingham. Aujourd'hui, je présente un protocole permettant d'obtenir des cultures organotypiques de thymus réagrégés, qui peuvent être utilisées pour étudier les interactions cellulaires complexes survenant durant la différenciation des lymphocytes T. Avant le début de cette procédure, des lobes thymiques embryonnaires ont été isolés et traités afin d'éliminer tous les lymphocytes.Cela peut être observé sur une vidéo séparée. Les lobes alienoïdes sont ensuite dissociés afin de produire une préparation de cellules stromales. Enfin, les cellules sont regroupées pour former une culture organotypique de réagrégat fmic.Commençons. Après cinq à sept jours de culture, les LO devraient être prêts à être dissociés pour préparer des cellules en suspension. Plongez les filtres de 0,8 micromètre dans une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640 supplémenté en 10 % de FCS. À l’aide de pinces, repoussez délicatement les pentes de fibres qui ne flottent pas. Utilisez une pipette de 1 ml pour transférer les lobes dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.Nous recommandons de ne pas dépasser 50 lobules par tube Eppendorf. Laisser les lobules se déposer au fond du tube par gravité unitaire et éliminer le milieu. Laver les lobules avec un millilitre de PBS, puis laisser les lobules redescendre au fond du tube.Répétez cela pour un total de trois lavages au PBS, retirez le dernier lavage au PBS et ajoutez 600 microlitres d'une solution de tripsine 0,25 %. Placez le tube Eppendorf dans une étuve à 37 degrés pendant 25 minutes. Triturez délicatement les lobes à l’aide d’une pipette munie d’une pointe bleue de 1 ml pendant 10 secondes, puis remettez le tube dans l’étuve ; après 20 minutes, pipetez les lobes vers le haut et vers le bas afin de les dissocier complètement.Il devrait falloir environ 30 secondes pour obtenir une suspension monocellulaire. Ajoutez 400 microlitres de RPMI 1640 glacé contenant 10 % de FCS afin de neutraliser la trypsine. Précipitez les cellules par centrifugation à 1 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C, éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans 1 ml de RPMI 1640 contenant 10 % de FCS si désiré. Dénombrer les cellules.Typiquement, nous nous attendrions à environ 50 000 cellules par lobe de dioxazine, à partir d'un tissu fibreux E15. Nous sommes maintenant prêts à former les cultures agrégées de fmic Corgan dans un tube d'orph de un millilitre et demi. Cellules stromales fines, mélangées et fraîchement préparées.Avec les fibrocytes pré-sélectionnés CD4 positifs CD8 positifs. Nous recommandons un rapport d'environ un pour un entre les cellules stromales et les fibrocytes. Le nombre de cellules que vous utiliserez dépendra du nombre de cellules disponibles et des expériences à réaliser.Nous recommandons au moins cent mille cellules au total et pas plus de 1,5 million de cellules. Vous souhaitez que les agrégats V soient suffisamment grands pour être reproductibles, mais pas trop grands au point que le centre meure. Faites tomber les cellules en culot par centrifugation à mille tr/min pendant 10 minutes. À quatre degrés C, assemblez soigneusement le filtre de culture d'organes.Retirer toutes les a SUP natin dans l'étape avec un P 200 par pet. Vortexer le culot cellulaire pendant 10 secondes pour former une suspension. Le volume doit être d'environ un à deux microlitres mouth.Étaler la suspension en une fine couche, en maintenant la suspension de cellules à l'extrémité du dispositif. Sous notre microscope stéréoscopique, placer délicatement par aspiration la suspension cellulaire au centre d'un filtre de 0,8 micromètre. Idéalement, les cellules doivent être déposées sous forme d'une goutte dressée en un cercle d'un à deux millimètres de diamètre.Si la suspension commence à s'étaler, laissez le liquide de la suspension s'écouler à travers le pos avant de déposer les cellules restantes. Placez la boîte dans une boîte plastique hermétique pour sandwich et fermez-la. Comme pour les cultures d'organes thymiques, placez une boîte dans une étuve ; les cultures forment des structures intactes dans les 18 heures suivant la mise en culture.Après quatre à cinq jours de culture, ils généreront des sous-populations de cytes matures CD quatre positif huit négatif et CD quatre négatif huit positif. À partir de 50 lobes traités à la dioxazine, on devrait obtenir suffisamment de cellules stromales pour préparer de trois à cinq cultures réagrégées. Ces cultures apparaissent généralement sous forme de monticules cohérents de cellules qui peuvent être décollés des filtres à l’aide de pinces sans être endommagés.Nous venons de décrire la méthode permettant d'étudier la sélection positive par les cellules épithéliales F. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier la sélection négative médiée par les cellules dendritiques. Enfin, en utilisant des fibrocytes transgéniques pour le TCR ou des cellules stromales déficientes en CMH de classe I ou en CMH de classe II.Ce système permet des études séparées de la sélection des lymphocytes T CD quatre positifs ou des lymphocytes T CD huit positifs. Merci d'avoir suivi.

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Cette vidéo montre la dissection et l'enlèvement du thymus du fœtus ainsi la préparation des cultures ex vivo de la 2-dGuo traités thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

Cette vidéo présente un protocole permettant de générer des lymphocytes T fonctionnels spécifiques de l’antigène à partir de lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC à l’aide d’un système de culture thymique tridimensionnelle. La co-culture des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC avec des lobes thymiques fœtaux fœtaux de souris endogènes appauvris en lymphocytes a permis de maturation réussie des lymphocytes T pour former des émigrants thymiques (iTE) dérivés de CD8αβ+ du CMH de classe I+.

Système de culture thymique tridimensionnelle pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Cet article décrit une méthodologie in vivo et in vitro pour caractériser les progéniteurs de sédimentation thymique par l’analyse de la cinétique de génération, du phénotype et du nombre de leur descendance de lymphocytes T.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Cette vidéo présente un protocole permettant d’enrichir les cellules épithéliales thymiques (TEC) avec un gradient de densité pour l’isolation FACS. Il montre également l’utilisation des peptides EAK16-II/EAKIIH6 pour favoriser la formation d’agrégats TEC. Les microenvironnements de l’hydrogel EAK16-II/EAKIIH6 fournissent la configuration 3D nécessaire pour maintenir la survie et la fonction des TEC.

Promotion 3-D agrégation de cellules FACS purifiées thymique épithéliales avec EAK 16-II / EAKIIH6 auto-assemblage Hydrogel

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Ce protocole décrit l’isolement de thymocytes doublement négatifs du thymus de souris, suivi d’une transduction rétrovirale et d’une co-culture sur le système de co-culture de lignée cellulaire stromale de moelle osseuse de type delta 4-exprimant la moelle osseuse (OP9-DL4) pour une analyse fonctionnelle plus approfondie.

Co-culture et transduction de thymocytes murins sur des cellules stromales exprimant 4-Delta-like pour étudier les oncogènes dans la leucémie à cellules T

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC cultivés dans des hydrogels de fibrine 3D visant à soutenir la maturation des cellules épithéliales thymiques (TEC) et le maintien prolongé, ainsi que la thymopoïèse in vitro.

Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Apprenez à préparer des cultures réagrégées de thymus traitées au 2-dGuo pour étudier la différenciation des lymphocytes T et les interactions cellulaires. Cette méthode génère des sous-populations CD4+ et CD8+.

Réagréger cultures Thymus

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