Réagréger cultures Thymus

Bonjour, je m’appelle Andrea White et je viens du laboratoire de Graham Anderson et Eric Jenkinson au MRC Center for Immune Regulation de l’Université de Birmingham. Aujourd’hui, je présente un protocole pour dériver des cultures d’organes thymiques réagrégés, qui peut être utilisé pour étudier les interactions cellulaires complexes qui se produisent lors de la différenciation des lymphocytes T. Avant le début de cette procédure, les lobes thymiques embryonnaires ont été isolés et traités pour éliminer tous les lymphocytes.

On peut le voir sur une vidéo séparée. Les lobes aliénoïdes sont ensuite désagrégés pour produire une préparation de cellules stromales. Et enfin, les cellules sont agrégées pour former une culture d’organe fmic réagrégée.

Commençons. Après cinq à sept jours de culture, l’OL doit être prêt à se désagréger pour les préparations de cellules de haut-fond : immergez les filtres de 0,8 micromètre dans une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640 plus 10 % FCS À l’aide d’une pince, poussez doucement les pentes de fibres qui ne flottent pas. Utilisez un mil par animal pour transférer les lobes dans un tube à orph de 1,5 mil.

Nous recommandons de ne pas dépasser 50 lobes par tube d’orph. Laissez les lobes se déposer au fond du tube sous l’effet de la gravité unitaire et retirez le fluide. Lavez les lobes avec un mil PBS, puis laissez les lobes couler à nouveau au fond.

Répétez cette opération pour un total de trois lavages PBS, retirez le dernier lavage PBS et ajoutez 600 microlitres d’un taux de 0,25 % dans la solution. Placez le tube einor dans un incubateur à 37 degrés pendant 25 minutes. Tritréfère doucement les lobes à l’aide d’une pointe bleue d’un mil sur un perpet pendant 10 secondes, puis remets dans l’incubateur après 20 minutes, pipette les lobes de haut en bas pour les désagréger complètement.

Cela devrait prendre environ 30 secondes Pour obtenir une suspension à cellule unique, ajoutez 400 microlitres de glace froide, RPMI 1640 plus 10 % FCS pour neutraliser la pastille de trypsine imp les cellules par centrifugation à mille tr/min, 10 minutes à quatre degrés C, retirez le sup natant et remettez le granulé en suspension dans un mil. RPMI 1640 plus 10 % FCS si vous le souhaitez. Comptez les cellules.

En règle générale, on s’attend à environ 50 000 cellules par lobe de dioxazine, à partir d’un E 15 fibreux. Nous sommes maintenant prêts à former l’agrégat des cultures de Corgan dans un tube d’orph d’un million et demi d’épaisseur. Cellules stromales fines mélangées, fraîchement préparées.

Avec un CD présélectionné, quatre fibrocytes positifs sont positifs. Nous recommandons un rapport d’environ un pour un entre les cellules stromales et les fibrocytes. Le nombre de cellules que vous utiliserez dépendra du nombre de cellules disponibles et des expériences à réaliser.

Nous recommandons au moins cent mille cellules au total et pas plus de 1,5 million de cellules. Vous voulez que les agrégats V soient suffisamment grands pour être reproductibles, mais pas trop grands pour que le centre meure les cellules de granulés par centrifugation à mille tr/min pendant 10 minutes. À quatre degrés C, assemblez soigneusement le filtre de culture d’organes.

Retirez tous les SUP natin en étape avec un P 200 par animal. La pastille de cellule vortex pendant 10 secondes pour former une boue. Le volume doit être d’environ un à deux microlitres de bouche.

Transformez la boue en un animal finement dessiné, en gardant la suspension des cellules à l’extrémité de l’animal. À l’aide de notre microscope de dissection, placez soigneusement la suspension cellulaire par TEP au centre d’un filtre de 0,8 micromètre. Idéalement, les cellules devraient être placées en goutte debout dans un cercle d’un à deux millimètres de diamètre.

Si la boue commence à s’étaler, laissez le liquide de la boue s’écouler à travers le pos avant de déposer les cellules restantes. Placez le plat dans une boîte à sandwich en plastique et fermez-la. En ce qui concerne les cultures d’organes de thymus, et placez une boîte dans un incubateur, nous agrégeons les cultures sous forme de structures intactes dans les 18 heures suivant la culture.

Après quatre à cinq jours de culture, ils produiront à la fois des sous-ensembles de cytes matures CD quatre positifs huit négatifs et CD quatre négatifs huit positifs. En commençant par 50 lobes traités à la dioxazine, on devrait obtenir suffisamment de cellules stromales pour préparer trois à cinq cultures de réagrégation. Ces cultures se présentent généralement sous la forme de monticules cohérents de cellules qui peuvent être repoussées hors des filtres à l’aide de pinces sans les perturber.

Nous venons de décrire la méthode d’étude de la sélection positive par les cellules épithéliales F. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier la sélection négative médiée par les cellules dendritiques. Enfin, en utilisant des FIBROCYTES transgéniques TCR ou des cellules stromales déficientes en CMH de classe un ou en CMH de classe deux.

Ce système permet d’examiner séparément la sélection des lymphocytes T positifs pour les cellules CD quatre ou les cellules T positives pour les cellules CD8. Merci d’être à l’écoute.