Name: Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Apprenez la préparation de cultures d'organe thymique fœtal traitées au 2-dGuo pour étudier le développement des lymphocytes T. Cette méthode permet d'analyser les interactions stromales et la dynamique cellulaire lymphoïde.

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S&#39;il vous plaît visitez <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocoles Springer</a> pour plus d&#39;informations sur la préparation des cultures ex vivo d&#39;orgue du thymus.

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

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Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

préparation de la 2-dguo cultures traitées orgue thymus

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Dans le thymus, les CD4 + thymocytes immatures 8 exprimant hasard réarrangés récepteur des cellules T α-et b-gènes de la chaîne subissent les épreuves de sélection positive et négative sur leur capacité à reconnaître complexe majeur d&#39;histocompatibilité self-peptide/major (CMH) exprimées par thymique Les cellules stromales. Dans l&#39;analyse in vivo du rôle des cellules stromales thymiques lors de la sélection intrathymique est rendue difficile par la complexité du microenvironnement cellulaire thymique dans le thymus adulte état stable, et par le manque de stratégies appropriées visant à manipuler l&#39;expression des gènes, en particulier thymique compartiments stromal. Nous avons montré que le microenvironnement thymique peut être facilement manipulées in vitro par l&#39;utilisation de cultures d&#39;organes réagréger thymus, qui permettent la préparation de trois dimensions lobes de thymus de définir les cellules stromales et lymphoïdes. Bien que d&#39;autres systèmes in vitro en charge certains aspects du développement des cellules T, réagréger culture d&#39;organe thymus reste le seul système in vitro en mesure de soutenir efficacement CMH de classe I et II à médiation épreuves de sélection thymocytes, et peut donc être utilisé comme un outil efficace pour étudier la régulation cellulaire et moléculaire de la sélection positive et négative dans le thymus.

Cette vidéo montre la dissection et l&#39;enlèvement du thymus du fœtus ainsi la préparation des cultures ex vivo de la 2-dGuo traités thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

Dans le thymus, on sait que les interactions entre les précurseurs des lymphocytes T en développement et les cellules stromales, lesquelles incluent les cellules épithéliales corticales et médullaires, jouent...

Bonjour, je suis Will Jenkinson, du groupe de Graham Anderson et Eric Jenkinson au Centre MRC pour la régulation immunitaire de l'Université de Birmingham. Aujourd'hui, je vais vous montrer une technique permettant de mettre en place des cultures d'organes thymiques fœtaux. De plus, je vais également vous montrer comment traiter ces cultures d'organes avec deux dioxazines.Et cette substance est sélectivement toxique pour les cellules lymphoïdes en culture d'organes. Cette technique présente plusieurs applications en laboratoire. L'une de ces applications est la production de cultures d'organes réagrégés.D'autres applications incluent l'étude des différents stades du développement des cytes et, à l'aide de cultures d'organes thymiques fœtaux, nous sommes en mesure d'ajouter des réactifs qui inhibent ou stimulent différentes voies, ce qui signifie que nous pouvons étudier le rôle de molécules spécifiques dans ce processus. Commençons donc. La première étape pour préparer des cultures d'organes thymiques consiste à prélever des embryons de souris du jour 14 ou 15 provenant d'une à deux femelles gestantes.Tout d'abord, vaporisez du mouse euthanasié avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, utilisez une pince pour tirer sur le pelage et pratiquer une incision en forme de V dans la région abdominale à l’aide de ciseaux, en partant de la vessie et en remontant le long des deux cornes latérales de l’utérus. Retirez la corne utérine et placez-la dans une boîte de Pétri stérile de 10 centimètres.Couper longitudinalement la paroi utérine et retirer les embryons encore dans leurs poches amniotiques. Les laver dans une boîte de Pétri contenant 10 ml de PBS à l’aide de deux paires de pinces fines. Ouvrir délicatement la poche amniotique et libérer l’embryon de la poche et du placenta.Ensuite, transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 10 mills d'un mélange 50-50 de PBS avec du RPMI 1640. Dans le milieu contenant 10 % de FCS, sous un microscope stéréo et avec l'embryon immergé dans le milieu, sectionnez la tête de l'embryon à l'aide de pinces. Ouvrez la surface antérieure de la paroi thoracique en insérant les extrémités d'une paire de pinces fermées dans la cavité thoracique, puis ouvrez les pinces pour exposer la cavité thoracique interne.Retirer l'ensemble de l'arbre thoracique, du cœur, des poumons, de la trachée et du thymus en pinçant doucement sous le cœur, puis placer le tout dans une boîte de 35 millimètres contenant cinq millilitres de RPMI 1640 supplémenté en 10 % de FCS chez un embryon âgé de 14 à 15 jours. Les lobes thymiques rudimentaires se situent juste au-dessus du cœur, de chaque côté du tronc ici.Retirer les lobes individuels du thymus à l’aide de fines pinces et éliminer également les tissus conjonctifs excédentaires ainsi que tout sang adhérent avant d’étendre en culture d’organe. Nous sommes maintenant prêts pour la culture d’organe. Pour préparer un milieu lymphoïde désintoxiqué, prendre un stock de deux dioxazine à neuf millimolaire et préparer 600 microlitres dans une boîte de Petri en plastique bactériologique de 90 millimètres.Ajoutez quatre millilitres de milieu DMEM préchauffé et faites tourner la boîte de manière à ce que l'ensemble de la surface soit recouverte par le milieu. Évidemment. Si vous souhaitez obtenir des cultures lymphoïdes pour étudier le développement des lymphocytes T, retirez les deux dioxazines à l’aide de pinces. Placez deux emballages stériles en papier, des éponges prédécoupées de un centimètre carré, dans la boîte.Laisser le milieu pénétrer dans l'éponge pendant environ 30 secondes. Ensuite, retourner l'éponge pour humidifier les deux côtés. Cela garantit que le milieu dans la boîte a accès au tissu, à nouveau à l’aide de pinces.Placer un filtre pré-stérilisé de 0,8 micron sur la surface de chaque éponge. Les filtres sont placés avec le côté brillant vers le haut sur les supports d'éponge afin de transférer les lobes thymiques sur le filtre de culture d'organe ; nous préférons utiliser une pipette en verre de contrôle mathématique pour fabriquer des pipettes en verre. Chauffer le tube en verre au-dessus d'une flamme de bec Bunsen et, lorsque le verre est malléable, retirer le verre de la flamme et tirer sur les deux extrémités pour étirer le verre à une longueur maximale de 10 centimètres, puis laisser refroidir le verre.Ensuite, tirez sur chaque extrémité pour casser le verre. Cela produit deux embouts en verre effilés. La zone fine de chacun mesure environ cinq centimètres de long, avec une pointe d'environ 0,5 millimètre de diamètre.Pour installer l'appareil de pipetage, placez une embout de pipette en plastique à l'autre extrémité en guise d'embout buccal et insérez l'extrémité émoussée d'une pipette en verre dans le tube. Prélevez délicatement les lobes du thymus un par un à l’aide de la pipette buccale et déposez-les à la surface du filtre en nor 0,8 micron. Pour la culture d'organes, nous recommandons de placer cinq à six lobes thymiques sur chaque filtre, soit un total de 10 à 12 lobes thymiques par boîte.Cela permet suffisamment d'espace pour la croissance des cultures d'organes et permet aux deux dioxazines d'éliminer toutes les cellules lymphoïdes endogènes. Une fois les cultures mises en place, assemblez un couvercle de boîte sandwich avec le couvercle d'une boîte de Pétri de 10 centimètres servant de plateforme et de l'eau doublement distillée juste en dessous du niveau de la plateforme. Placez jusqu'à trois boîtes dans la boîte et scellez le couvercle à la boîte avec du ruban adhésif.Le couvercle doit présenter deux trous d'aération de cinq millimètres percés dans des coins opposés. Placer les boîtes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 10 %CO2 pendant cinq à sept jours, après quoi nous désagrégons puis réagrégons ces cultures afin d'étudier les interactions au niveau du site thymique stromal dans un environnement tridimensionnel contrôlé. Après une période de culture, généralement de cinq à sept jours, les F talks sont récoltés en immergeant les filtres dans le milieu et en détachant délicatement les lobes à l’aide de pinces ; on peut observer que les f tos lymphoïdes sont généralement plus petits et kystiques par comparaison avec les lobes lymphoïdes non traités à la dioxazine.J'ai donc vient de vous montrer la technique permettant de mettre en place des cultures d'organes thymiques fœtaux. Dans ce protocole, nous vous avons montré comment traiter les cultures d'organes thymiques fœtaux avec deux dioxazine, ce qui élimine généralement toutes les cellules lymphoïdes après cinq à sept jours de culture du thymus. Nous utilisons ces cultures d'organes pour produire des cultures d'organes réagrégés.Cependant, cette technique n'est pas la seule utilisée. Nous utilisons également des cultures organotypiques thymiques fœtales non traitées à la dioxazine, que nous transférons sous la capsule rénale de souris thymiques. De plus, nous utilisons des cultures organotypiques thymiques fœtales lymphoïdes pour étudier le développement des cellules T dans des conditions contrôlées in vitro, exemptes de tout effet secondaire pouvant survenir in vivo.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Dans cette vidéo, la préparation de la 2-dGuo traités réagréger cultures thymus est démontrée.

Réagréger cultures Thymus

Nous avons développé des outils de laboratoire roman et de protocoles pour l'acquisition d'imagerie intravitale du thymus. Notre technique devrait aider à l'identification de «niches» dans le thymus où le développement des cellules T se produit.

Imagerie intravitale du Thymus souris utilisant la 2-microscopie biphotonique

Cette vidéo présente un protocole permettant de générer des lymphocytes T fonctionnels spécifiques de l’antigène à partir de lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC à l’aide d’un système de culture thymique tridimensionnelle. La co-culture des lymphocytes T immatures dérivés d’iPSC avec des lobes thymiques fœtaux fœtaux de souris endogènes appauvris en lymphocytes a permis de maturation réussie des lymphocytes T pour former des émigrants thymiques (iTE) dérivés de CD8αβ+ du CMH de classe I+.

Système de culture thymique tridimensionnelle pour générer des émigrants thymiques dérivés d’iPSC

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

L’étude in vitro des cellules épithéliales thymiques médullaires a été largement infructueuse, car les systèmes de culture 2D actuels n’imitent pas le scénario in vivo. Le système de culture 3D décrit ici - un modèle de culture organotypique de peau modifié - s’est avéré supérieur pour récapituler la prolifération des mTEC, la différenciation et le maintien de l’expression des gènes de promiscuité.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Cet article décrit une nouvelle méthode pour produire des émigrants thymiques pluripotents induits par l'antigène-spécifique de tumeur (iTE) par un système de culture thymique tridimensionnel (3D). iTE sont un sous-ensemble homogène de lymphocytes T étroitement liés aux lymphocytes T naïfs avec la capacité de prolifération, de formation de mémoire, et de suppression de tumeur.

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

Nous fournissons une méthode simple et efficace pour transplanter 2'-deoxyguanosine traité E18.5 thymus dans la capsule rénale d'une souris nue. Cette méthode devrait aider dans l'étude de la fonction des cellules épithéliales thymiques et de la maturation des lymphocytes T.

Transplantation sous-capsulaire rénale du thym embryonnaire Murine traité à la déoxyguanosine de 2'-Deoxyguanosine chez les souris nues

Ici, nous décrivons un protocole pour la formation d’organoïdes de thymus humains dérivés d’iPSC cultivés dans des hydrogels de fibrine 3D visant à soutenir la maturation des cellules épithéliales thymiques (TEC) et le maintien prolongé, ainsi que la thymopoïèse in vitro.

Formation d’organoïdes de thymus humain dans des hydrogels de fibrine tridimensionnels

Apprenez la préparation de cultures d'organe thymique fœtal traitées au 2-dGuo pour étudier le développement des lymphocytes T. Cette méthode permet d'analyser les interactions stromales et la dynamique cellulaire lymphoïde.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

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