Name: Préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Apprenez à préparer et maintenir des cultures compartimentées de neurones ganglionnaires de la racine dorsale issus d'embryons de rat E15. Cette technique permet d'étudier la croissance axonale et la signalisation neurotrophique.

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Nous tenons à remercier Katharina Cosker et Stephanie Courchesne pour les discussions utiles.

Préparation des réactifs <ol><li> Revêtement collagène: le collagène manteau de p35 plaques de culture tissulaire et les placer dans une étuve à 37 ° C pendant 2 jours avant le graissage des diviseurs. La concentration finale de collagène devrait être à 0,71 mg / ml dilué dans 0,001 N HCl. Puis, ajoutez 1 ml de mélange par plaque. </li><li> Chargeurs de graisse: Afin de combler le chargeur de graisse, une seringue de 60 ml doit d'abord être rempli de graisse à vide Corning. Utiliser la seringue pour remplir le chargeur de la graisse, l'envelopper dans du papier et ensuite l'autoclave pendant 45 minutes. </li><li> Diviseurs Téflon: les diviseurs peuvent être réutilisés après chaque expérience, mais doit d'abord être bien nettoyés. Retirez le diviseur de la plaque, essuyez toutes les graisses restantes et les placer dans l'acide sulfurique pendant 2 jours. Après avoir retiré de l'acide, rincer à l'eau 3X, faire bouillir pendant 20 minutes, laisser sécher, placer dans un plat en verre P100 de Pétri et l'autoclave pendant 20 minutes. </li><li> N2-méthylcellulose: Peser 1,5 g de méthylcellulose et le placer dans une bouteille de 500 ml. Ajouter un barreau et il autoclave pendant 20 minutes à sec (à partir de ce point de tous les travaux doivent être stériles). Ensuite, ajoutez 500 ml de sérum médias libres (N 2), et mélanger dans une chambre froide jusqu'à ce qu'elle se dissolve. Aliquoter en 50 ml Coniques et congeler à -20 ° C. Pour le stock, partie aliquote de travail l'un des 50 Coniques mL dans des tubes de 1 ml et congeler à -20 ° C. </li><li> DRG médias: DMEM, 5% de sérum de cheval inactivé par la chaleur, la streptomycine et 1% de pénicilline. </li><li> 100ng/mL DRGN médias: La concentration des stocks de ces deux facteurs de croissance nerveuse (NGF) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est 1mg/mL. Diluer chacun des neurotrophines 1:10.000 dans les médias DRG. Les cultures peuvent être cultivées dans NGF seul; cela modifie le complément de neurones qui survivent dans les cultures. Remarque: Si nécessaire, la concentration de (cytosine arabinoside) Arac est 1um et utilisé à une concentration finale de 0.3uM. Ce sera d'inhiber la croissance des cellules de Schwann et des cellules gliales d'autres. </li><li> 10ng/mL DRGN médias: Diluer le 100ng/mL DRGN médias (01h10) avec les médias DRG. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figure 1" width="392" height="294"> Outils Figure 1. Nécessaire pour mettre en place </li></ol> Mise en place des chambres compartimentées (démarrer ce processus 1-2 jours avant la dissection) <ol><li> Faire une égratignure au milieu d'un revêtues de collagène p35 plat avec un mouvement vers l'extérieur. </li><li> 30ul Lieu de N2-méthylcellulose sur le milieu de la rayure. Set plats de côté jusqu'à ce diviseur est graissé. </li><li> Fixez un adaptateur de calibre 23 talon de Luer pour le chargeur de graisse. Saisir le diviseur de Teflon avec une paire de pinces hémostatiques 90 ° d'angle et le poser à plat avec le diviseur vers le haut sous un microscope. Trace le diviseur avec de la graisse en s'assurant que chaque fois que l'adaptateur est placé à un nouveau point de départ de l'adaptateur est inséré dans la graisse de l'étape précédente afin qu'il y ait une ligne continue de la graisse (voir schéma). Une fois que la graisse est appliquée à l'ensemble du diviseur, tournez l'un des plats préparés p35 à l'envers et la placer de sorte que le N2-méthylcellulose est sur le compartiment du milieu. Appuyez sur le fond du plat avec une paire de pincettes. Veillez à appuyer sur l'intérieur de la cloison dans les quatre coins (en haut à gauche, en bas à droite, en haut à droite, en bas à gauche, indiqué dans le schéma par «X»). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figure 2" width="171" height="183"> Figure 2: Étapes pour graisser le diviseur Remarque: Il est important d'appuyer assez fermement pour que la graisse fait une étanchéité totale avec le plat, mais si trop de pression est ajoutée, les axones ne franchira pas dans les compartiments latéraux. Ramassez les pinces hémostatiques, retournez-le et débrider le diviseur. Enfin, placez le plat avec le diviseur fermement attaché sous le microscope se concentrant sur le fond du compartiment du milieu. Avec le chargeur de la graisse, faire une petite barrière (0,25 cm) de sorte qu'une fois que les cellules sont placées dans le compartiment central, ils ne peuvent pas s'échapper. </li><li> Après avoir mis en place plusieurs cultures, les médias DRG place dans chacun des compartiments latéraux et les placer dans un incubateur dans lequel les cellules seront maintenues. Autoriser les cultures de s'asseoir pendant plusieurs heures et ensuite vérifier les fuites. Si les médias ont fui dans le compartiment du milieu, puis la culture est inutilisable. Remarque: Lors de la première formation à cette technique, il est important de mettre en place des cultures plus que nécessaire pour une expérience, que plusieurs seront étanches. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figure 3" width="254" height="191"> Figure 3: "Bonne vs fuient la« culture </li></ol> Le maintien des neurones DRG dans les cultures compartimentées <ol><li> Jour 1: Remplacer DRG des médias dans les compartiments latéraux avec 100ng/mL DRGN médias + AraC. Effectuer la dissection et ajouter des cellules à compartiment central (100 000 cellules). </li><li> Jour 2: Ajouter 10ng/mL médias + AraC à l'extérieur du diviseur de téflon jusqu'à ce que le flux média au cours de la barrière de la graisse fluide et les échanges avec le compartiment central. </li><li> Jour 3: Remplacer les médias dans les compartiments latéraux pour 100ng/mL DRGN omettant l'ARAC et l'entourer de 10ng/mL DRGN omettant l'ARAC. </li><li> Jour 6: Remplacer les médias dans les compartiments latéraux pour 1ng/ml + AraC et les entourer avec les médias DRG + AraC. </li><li> Jour 9: Utilisation de l'expérimentation. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figure 4" width="267" height="148"> Figure 4: les images IHC des corps cellulaires et les axones distaux Remarque: Lorsque vous changez les médias, il est important d'aspirer le liquide de la partie supérieure du compartiment côté chacun. Aussi, ne jamais changer le support du compartiment milieu lui-même, seulement de l'entourer, et laissez couler sur la barrière de graisse dans le centre. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

Dans cette vidéo, nous avons montré comment préparer et entretenir les chambres compartimentées pour une utilisation dans les neurones DRG culture. Fait correctement, ce système permet la séparation des corps de la cellule de l&#39;axone, afin d&#39;étudier les mécanismes par lesquels les neurotrophines signal à travers longs axones. Comme il est l&#39;isolement fluidique entre les compartiments, il permet une stimulation sélective ou le traitement d&#39;un compartiment, sans les autres compartiments touchés. Cultures de chambre à compartim...

<table><tbody><tr><td>collagène</td><td>Réactif</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>méthylcellulose N2 400CPS</td><td>Réactif</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>séparateur en téflon</td><td>Autre</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>de nombreux autres types de séparateurs sont disponibles</td></tr><tr><td>râteau à broches</td><td>Outil</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>chargeur de graisse</td><td>Outil</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Réactif</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Réactif</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>graisse à haute vacuité</td><td>Réactif</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>adaptateur luer 23 gauge</td><td>Outil</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>pinces hémostatiques à angle de 90&amp;#x00B0;</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurones étendre les processus axonal qui sont loin du corps cellulaire pour innerver les tissus cibles, où la cible des facteurs de croissance dérivés sont nécessaires pour la survie des neurones et la fonction. Les neurotrophines sont spécifiquement requis pour maintenir la survie et la différenciation des neurones sensoriels innervant mais la question de savoir comment ces neurotrophines cibles dérivées de communiquer vers le corps cellulaire des neurones innervant a été un domaine de recherche actif depuis plus de 30 ans. Le modèle le plus communément acceptée de la façon dont les signaux atteignent neurotrophine du corps cellulaire propose que la signalisation endosomes réaliser ce signal rétrograde le long de l&#39;axone. Afin d&#39;étudier le transport rétrograde, un système de culture a été initialement conçu par Robert Campenot, dans laquelle les corps cellulaires sont isolés de leurs axones. La technique de préparation de ces chambres compartimentées pour les récapitule en culture des neurones sensoriels de la stimulation sélective des terminaisons neuronales qui se produit dans le communiqué suivant in vivo de cibles dérivées de neurotrophines. Rétrograde événements de signalisation qui exigent longue portée transport rétrograde microtubules dépendants ont des implications importantes pour le traitement des troubles neurodégénératifs.

Nous décrivons ici la technique de la préparation et l&#39;entretien des chambres compartimentées pour les neurones sensoriels en culture des ganglions de la racine dorsale.

Préparation et entretien des neurones ganglions de la racine dorsale dans les cultures à compartiments

Les neurones prolongent des prolongements axonaux, situés loin du corps cellulaire, pour innerver des tissus cibles, où des facteurs de croissance dérivés de la cible sont nécessaires pour...

Cette procédure commence par la réalisation d'une égratignure au centre d'une plaque revêtue de collagène à l'aide d'un peigne à égratigner, puis par l'aspiration de 30 microlitres de méthylcellulose au centre des égratignures. Graissez chaque séparateur à l’aide d’un applicateur de graisse et fixez-le sur une plaque revêtue de collagène. Introduisez 100 000 cellules provenant d’embryons de rat au stade E15 dans le compartiment central.Après neuf jours, les cellules auront étendu leurs axones dans le compartiment latéral et seront prêtes pour l'expérimentation. Bonjour, je suis Maria Murphy du laboratoire de la Dre Rosalyn Siegel, du Département d'oncologie pédiatrique de l'Institut du cancer Dana-Farber. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour la préparation et l'entretien de neurones des ganglions de la racine dorsale en cultures compartimentées.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la signalisation des neurotrophines. Commençons donc. Avant de préparer les chambres compartimentées, les plaques de culture tissulaire P 35 doivent être recouvertes de collagène.Pour ce faire, ajoutez un millilitre d'une solution de collagène à 0,71 milligramme par millilitre dans du HCl 0,001&nbsp;N dans les plaques et incubez-les à 37&nbsp;degrés Celsius pendant deux jours. Après deux jours, réalisez une rayure au milieu des plaques recouvertes de collagène à l'aide d'un peigne à épingles. Utilisez un mouvement vers l'extérieur.Ensuite, déposez 30 microlitres de N deux méthylcellulose au centre de la rayure. Mettez les boîtes de côté. Puis, fixez un embout adaptateur de type 23 gauge au chargeur graisseux.Saisir le séparateur en téflon avec une pince hémostatique à angle de 90 degrés et le placer à plat, côté séparateur vers le haut, sous un microscope. En regardant à travers l'oculaire, appliquer du graissage sur le séparateur. Veiller à ce que chaque fois que l'adaptateur est placé à un nouveau point de départ, il soit inséré dans la graisse de l'étape précédente afin d'obtenir une ligne continue de graisse.Une fois la graisse appliquée sur tout le séparateur, retournez l'un des plats P 35 préparés et placez-le de sorte que le N deux Methylcellulose se trouve au-dessus du compartiment central. Appuyez sur le fond du plat à l’aide d’une paire de pinces. Veillez à appuyer à l’intérieur du séparateur aux quatre coins.Il est important d'appuyer suffisamment fermement pour que la graisse forme un joint étanche complet avec la boîte. Toutefois, si une pression excessive est appliquée, les axones ne traverseront pas vers les compartiments latéraux. Ensuite, prenez les hémostats.Retournez la boîte et desserrez le séparateur. Ensuite, placez la boîte avec le séparateur fermement fixé sous le microscope, en focalisant sur le fond du compartiment central. Utilisez le chargeur de graisse pour former une petite barrière reliant les deux côtés du séparateur, d'une hauteur d'environ un quart de centimètre.Cette étape empêchera les cellules de s'échapper une fois qu'elles seront placées dans le compartiment central. Après avoir mis en place plusieurs cultures, ajoutez le milieu pour ganglions rachidiens dans chacun des compartiments latéraux. Ensuite, placez le dispositif dans l'incubateur où les cellules seront maintenues.Laisser les cultures reposer pendant plusieurs heures, puis vérifier s'il y a des fuites. Si le milieu s'est infiltré dans le compartiment central, la culture est inutilisable. Lorsqu'on apprend cette technique pour la première fois, il est important de préparer plus de cultures que nécessaire pour une expérience, car plusieurs d'entre elles seront probablement sujettes aux fuites.Après avoir confirmé que les chambres compartimentées sont utilisables, procédez à l'entretien de la culture de neurones de ganglions de la racine dorsale. Avant l'expérimentation, les neurones du GRD sont maintenus dans des cultures compartimentées. Pendant une période de neuf jours à 37 degrés Celsius à partir du jour un, remplacez le milieu des neurones du GRD dans les compartiments latéraux par 100 nanogrammes par millilitre.Le milieu DRGN plus le milieu A-C-D-R-G-N contient à la fois le facteur de croissance nerveuse et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau. La recette de ce milieu est disponible dans notre protocole écrit. Réalisez la dissection sur des embryons de rat au jour E15 et ajoutez 100 000 cellules dans le compartiment central.Le deuxième jour, ajouter 10 nanogrammes par millilitre de milieu DRGN plus un C à l'extérieur du séparateur en téflon jusqu'à ce que le milieu franchisse la barrière de graisse et échange du liquide avec le compartiment central. Le troisième jour, remplacer le milieu des compartiments latéraux par du milieu DRGN contenant 100 nanogrammes par millilitre, en omettant le a c.Remplacer également le milieu environnant par 10 nanogrammes par millilitre de DRGN, en omettant le RSC au jour six. Remplacer le milieu dans les compartiments latéraux par un nanogramme par millilitre de DRGN contenant le RSC, et le milieu environnant par du milieu DRG contenant le RSC.Le neuvième jour, le système de culture compartimenté est prêt pour l'expérimentation. Une fois l'expérimentation terminée, les séparateurs en téflon peuvent être réutilisés, mais doivent être correctement nettoyés. Pour ce faire, retirez le séparateur de la plaque et essuyez tout le gras résiduel.Ensuite, placer dans de l'acide sulfurique pendant deux jours. Après deux jours, retirer les cloisons de l'acide et les rincer à l'eau trois fois, puis les faire bouillir pendant 20 minutes et les laisser sécher. Placer les cloisons sèches dans une boîte de Pétri en verre P 100 et stériliser à l'autoclave pendant 20 minutes ; après stérilisation, elles seront prêtes pour des expériences ultérieures.Ce système de culture compartimenté permet de séparer le corps cellulaire de l'axone afin d'étudier les mécanismes par lesquels les neurotrophines transmettent des signaux à travers de longs axones. Étant donné qu'il existe une isolation fluidique entre les compartiments, il est possible de stimuler ou de traiter sélectivement un compartiment sans affecter les autres compartiments. Nous venons de vous montrer comment préparer et maintenir des neurones des ganglions de la racine dorsale en cultures compartimentées.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d'appuyer doucement lors de la fermeture du séparateur graisseux sur la plaque revêtue de collagène. Aspirez le liquide du haut de chaque compartiment latéral lors du changement du milieu, afin de ne pas perturber les axones. Ne changez jamais le milieu directement à partir du compartiment central lors de l'alimentation des neurones.Changez uniquement le milieu dans l’enceinte périphérique et laissez-le s’écouler par-dessus la barrière de graisse vers le compartiment central. Voilà, c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Cette vidéo montre une procédure permettant d’isoler les neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) à partir d’embryons de rats et de les co-cultiver avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann matures. Les DRG isolés sont traités pour isoler les neurones et les cellules gliales. Les cellules isolées sont cultivées pour purifier les neurones, qui sont ensuite co-cultivés avec des cellules de type cellules de Schwann (SCLC) dans un milieu de co-culture.

Isolement de neurones DRG et coculture avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann

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Préparation de boîtes de culture compartimentées enrobées de collagène pour la culture de cellules neuronales

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Technique de prélèvement et de dissociation des ganglions de la racine dorsale pour les cultures neuronales

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Co-culture d’un explant de ganglion de la racine dorsale avec des cellules de Schwann pour la myélinisation des neurones

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