Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Ce vidéo montre les différentes étapes de l'immunohistochimie en montage entier chez l'embryon de poulet en utilisant des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP). Premièrement, l'embryon est fixé dans du paraformaldéhyde. Ensuite, l'activité peroxydasique endogène est bloquée.

L'embryon est ensuite incubé avec un anticorps primaire. Après plusieurs lavages, l'embryon est incubé avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP). La réaction colorimétrique est révélée à l'aide du substrat DAB, et la coloration par les anticorps apparaît en orange. L'avantage de cette méthode par rapport à l'utilisation d'anticorps fluorescents est que les embryons peuvent être traités pour être inclus en paraffine, permettant ainsi l'étude des sites antigéniques en coupe transversale.

Bonjour, je suis Delphine du Laboratoire de FIN au Centre de médecine environnementale et génomique de Texas A&M à Houston. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure permettant de réaliser des immunomarquages avec des anticorps conjugués à la peroxydase (HRP) sur des embryons de poussin. Nous utilisons cette procédure au laboratoire pour étudier la morphologie des embryons après traitement par des médicaments anticonvulsivants.

Commençons par réaliser une immunohistochimie sur embryon entier chez le poulet. Ouvrez d'abord un œuf en tapotant la coquille avec une pince et en retirant des morceaux de coquille. Retirez l'albumen épais à l’aide d’une pince et inclinez le sac vitellin avec une pince grossière afin que l’embryon soit orienté vers le haut.

Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour découper un carré de la poche vitelline autour de l'embryon. Retirez l'embryon du vitellus à l’aide d’une cuillère et placez-le dans une boîte contenant du PBS sous un microscope stéréo. Retirez soigneusement les membranes présentes dans le vitellus et transférez l’embryon dans une boîte neuve contenant du PBS.

Après le transfert de l'embryon, fixez-le à l'aide de pinces et d'épingles à insectes, puis aspirez le PBS. Remplacez-le par du PFA à 4 % dans du PBS et laissez fixer l'embryon pendant une heure à température ambiante afin de minimiser toute contamination microbienne potentielle. Utilisez de l'H2O désionisée D pour toutes les étapes suivantes une fois l'embryon fixé, aspirez la solution de fixateur et éliminez-la correctement comme déchet chimique.

Remplissez la boîte avec du BS. Ensuite, à l’aide d’un couteau de microdissection, découpez un carré autour de l’embryon pour enlever les membranes extra-embryonnaires. Retirez les épingles à insectes avec une pince une fois que les épingles ont été enlevées. Utilisez une pipette Pasteur à extrémité émoussée pour transférer l’embryon dans un flacon de scintillation contenant du PBT.

Laver l'embryon trois fois avec du PBT, 10 minutes à chaque fois. Retirer le PBT du flacon scintillant et le remplacer par du PBTX contenant 0,3 % de H₂O₂ afin d'inactiver la peroxydase endogène éventuelle. Incuber deux heures à température ambiante sur un agitateur.

Lavez l'embryon avec du PBT d'abord trois fois pendant 10 minutes chacune, puis trois fois pendant 30 minutes chacune. Pour colorer l'embryon avec un anticorps, commencez par laver l'embryon pendant une heure dans un tampon de blocage ou dans du 1 % BSA 1 % NGS.

Nous utilisons le séquençage de nouvelle génération (NGS) car l'anticorps secondaire est produit chez la chèvre. Incuber sur mutator pendant une heure à température ambiante ; après l'incubation, diluer l'anticorps primaire au demi dans le tampon de blocage et incuber l'embryon dans cette solution pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Sur mutator.

Le facteur de dilution de l'anticorps primaire dépend du choix de l'anticorps primaire. Ici, nous utilisons un anticorps provenant de la banque hybride DOMA pour les études du développement, fourni sous forme de super natin. Nous le diluons au demi dans le tampon de blocage.

Ensuite, effectuez trois lavages de 10 minutes dans du PBT, suivis de trois lavages d'une heure dans du PBT. Après les lavages, diluez l'anticorps secondaire au 1/2 500 dans du tampon de blocage. Dans ce cas, utilisez un anticorps IgG de chèvre anti-US conjugué à la peroxydase et incubez l'embryon dans cette solution toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation.

Effectuer trois lavages de 10 minutes dans du PBT, suivis de trois lavages d'une heure dans du PBT, afin de développer la réaction colorée de l'embryon coloré. Réaliser ensuite deux lavages de 20 minutes dans du tampon tris (tris 100 millimolaire, HCl, pH 7,4). Ensuite, retirer le dernier lavage de tampon TS du flacon contenant l'embryon et le remplacer par cinq millilitres de solution de DAB.

Gardez-le à l’obscurité sur le mutateur pendant 20 minutes. Jetez la pointe d’einor dans le seau contenant une solution d’eau de javel à 10 %. Afin de décontaminer le DAB, ajoutez 16 microlitres.

Ajouter du H2O2 stock au flacon contenant les embryons dans le DAB. Garder à l’obscurité. Après 10 minutes, surveiller la réaction au microscope jusqu’à ce que la coloration soit complète. Éliminer le DAB dans un seau d’eau de javel, puis le remplacer par cinq millilitres.

Eau du robinet. Ensuite, effectuez deux lavages de 10 minutes dans du PBS pour préparer l'échantillon à la photographie et à l'inclusion en paraffine. Déshydratez l'embryon coloré dans une série d'éthanol à 25 %, 50 %, 75 % et 100 %, pendant 10 minutes chacun.

Après la déshydratation, remplacez l'éthanol par 0,5 à un millilitre d'huile de bois de cèdre. Cela rendra l'embryon translucide, facilitant la prise de photographies dans l'huile de bois de cèdre. Après la photographie, remettez l'embryon dans le flacon et remplacez l'huile de bois de cèdre par de l'éthanol à 100 %.

Enfin, remplacez l'éthanol par du vert rapide FCF à 5 % dans de l'éthanol à 100 % et incubez pendant trois minutes. Cette étape rendra les embryons visibles pour l'histologie. Remplacez la solution de vert rapide FCF par de l'éthanol à 100 % et procédez à l'histologie.

Voici trois exemples d'embryons colorés. Ces embryons au stade 11 sont marqués avec l'anticorps 15.3 B neuf ou non. Il s'agit d'un anticorps spécifique de la corde dorsale mis au point dans le laboratoire de Jane Dod et Tom Gessel.

Après deux minutes dans le DAB, l'embryon est encore transparent. Après 20 minutes dans le DAB, une légère coloration apparaît dans le cordon nodal. Enfin, après 40 minutes, la coloration du cordon nodal est complète.

Dans cet exemple, nous montrons comment l'anticorps PAC seven, développé dans le laboratoire de Tom Jessel, reconnaît les premiers stades de la fermeture du tube neural ainsi que les cellules de la crête neurale crânienne émergeant du mésencéphale. Ici, l'embryon est marqué avec la sonde Croc 20 provenant du laboratoire de David Wilkinson, suivie non pas d'un anticorps. Nous venons de vous montrer comment réaliser une immunohistochimie sur embryon entier.

Cette procédure peut également être utilisée sur des embryons qui ont été préalablement traités pour une hybridation in situ en montage entier. Dans ce cas, fixez brièvement l'embryon pendant une heure après l'hybridation in situ, puis procédez à la coloration immunohistochimique. Voilà, c'est terminé.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.