Name: Une technique de recueil de série du liquide céphalorachidien de la grande citerne de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Découvrez une technique de ponction du liquide céphalorachidien chez la souris transgénique modèle de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode permet un prélèvement en série pour suivre l'évolution des biomarqueurs Aβ et tau.

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Notre travail est soutenu par des subventions du NIH et de NS048447 AG017216to KD. Li Liu tiens à remercier le Dr Heikki Tanila (Université de Kuopio, Kuopio, Finlande) pour sa supervision et du soutien lors du développement du protocole original.

Tirer sur le tube capillaire en verre <ol><li> Le tube capillaire en verre est acheté à La Inc Sutter Instrument (verre borosilicate, le B100-75-10). </li><li> Tirez les tubes capillaires sur une Sutter P-87 Flaming micropipette extracteur, avec l'indice de chaleur fixé à 300 et l'indice de pression fixé à 330. </li><li> Coupez le bout du tube capillaire en verre avec des ciseaux, de sorte que la pointe conique a un diamètre intérieur de 0,5 mm environ. </li></ol> Technique de la ponction Cisterna magna pour LCR Les échantillons de LCR sont tirés de la grande citerne (figure 1) en utilisant une méthode qui a déjà été publiée 1. <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="Schéma d’anatomie cérébrale : cervelet, citerne magna, cortex, étiquettes du tronc cérébral." width="432" height="184" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 1. Les souris sont anesthésiés par la kétamine (100mg/kg) et de xylazine (10mg/kg), administrée par voie intrapéritonéale. Pendant le temps de l'induction anesthésique, les souris sont conservés dans un incubateur à 37 o C. 2. La peau de la nuque est rasée, et la souris est alors placée sur l'instrument sujettes stéréotaxique avec contact direct d'un coussin chauffant. Une sonde de température rectale est inséré dans le rectum afin que la chaleur produite par le coussin chauffant est ajustée en réponse aux changements de température du corps. La tête est fixée avec les adaptateurs tête. Le site chirurgical est frottée avec de l'iode povidone 10%, suivie par l'éthanol 7 0% (répéter 3 fois), et une incision sagittale de la peau est faite inférieure à l'occiput. 3. Sous le microscope de dissection, le tissu sous-cutané et les muscles (m. biventer cervicis et m. rectus capitis dorsalis majeur) sont séparées par dissection avec une pince. Une paire de microretractors est utilisé pour maintenir les muscles de l'autre. 4. La souris est fixée de telle sorte que la tête forme un angle de près de 135 o avec le corps. 5. Sous le microscope de dissection, la dure-mère de la grande citerne apparaît comme un triangle étincelant et clair inverse par lequel le bulbe rachidien et un vaisseau sanguin majeur (artère spinalis dorsalis), et l'espace LCR sont visibles (figure 2). <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="Démonstration d’anatomie chirurgicale ; procédure de dissection ; l’exposition des tissus ; à des fins éducatives." width="304" height="307" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 6. La dure-mère est effacée à sec avec un coton-tige stérile. Pénétrer le tube capillaire dans le Citerna magna travers la dure-mère, latéral à la spinalis artère dorsale (figure 2). Suite à un changement notable dans la résistance à l'insertion du tube capillaire, la LCR se jette dans le tube capillaire. 7. Retirer délicatement le tube capillaire, et le connecter à une seringue de 3 ml à travers un tuyau de polyéthylène qui a un diamètre interne de 1 mm. Injectez la LCR dans un tube pré-marqués 0,5 ml Eppendorf, et de geler le tube immédiatement sur glace sèche et ensuite le transférer dans un congélateur à -80 ° C. 8. Après le prélèvement du LCR, les muscles sont ré-alignés, et la peau est suturée (4-0, Ethicon, Johnson &amp; Johnson). Environ 1 ml de NaCl 0,9% d'injection sous-cutanée pour éviter la déshydratation. La souris est maintenu à l'incubateur de maintenir la température du corps jusqu'à ce qu'il récupère, le poids de la souris est surveillé 1 jour et 1 semaine après la chirurgie. Résultats et discussion Nous avons décrit un protocole très fiable pour l'échantillonnage de série de LCR chez des souris sans contamination du plasma détectable. 1. Toute la procédure prend généralement 10 min par la souris (y compris l'anesthésie). Le volume de LCR obtenus dépend du souches de souris. Dans le PS / APP doubles souris Tg, nous avons utilisé 2, le volume moyen est d'environ 5 pl (3 à 7 pi), tandis que le P301L (JNPL3) souris 3 donnent un rendement d'environ 10 ul ul-15. Pour l'échantillonnage de série, un maximum de 7-8 ul ne peut être sans risque pris à chaque fois à un intervalle de 2-3 mois. 2. Pendant la chirurgie, il est important de positionner la tête et le corps de la souris correctement sur le cadre stéréotaxique de telle sorte que la dure-mère de grande citerne peut être exposé suffisamment. Eviter soigneusement les vaisseaux sanguins lors de la pénétration de la dure-mère avec le tube capillaire pour éviter la contamination à partir des protéines du plasma, qui peuvent être suivis dans l'échantillon de LCR par immunoblot pour ApoB 4. 3. Minimiser les dommages tissulaires lors de chaque opération est importante, car conglutination tissus peut augmenter la difficulté par un saignement de prédisposition pour l'échantillonnage suivant. 4. La température du corps doit être bien entretenu pendant la chirurgie, car l'hypothermie causée par l'anesthésie peut affecter de manière significative les niveaux de tau phosphorylée dans le cerveau très rapidement 5. 5. L'Ab protocole ELISA et des anticorps que nous avons utilisés ont été décrits en détail dans Refolo et al. 6. Deux ul de LCR de la souris PS / APP donnera des résultats satisfaisants lorsque dilué 1:50-1:60. Pour le test ELISA de tau, 4-5 LCR pi de P301L (JNPL3) souris sera suffisante pour laDétection du total des tau, ou tau phosphore ylated au thréonine 231 (kits sont achetés auprès de Bio-Source). 6. Cette technique peut être appliquée à d'autres modèles de souris de maladies neurologiques, dont un petit volume de LCR est satisfaisante pour les dosages souhaités.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

Nous avons décrit un protocole très fiable pour l&#39;échantillonnage de série de LCR chez des souris sans contamination du plasma détectable. 1. Toute la procédure prend généralement 10 min par la souris (y compris l&#39;anesthésie). Le volume de LCR obtenus dépend du souches de souris. Dans le PS / APP doubles souris Tg, nous used2, le volume moyen est d&#39;environ 5 pl (3 à 7 pi), tandis que le P301L (JNPL3) souris 3 donnent un rendement d&#39;environ 10 ul ul-15. Pour l&#39;échantillonnage de série, un maximum de 7-8 ul ne peut...

une technique de recueil de série du liquide céphalorachidien de la grande citerne de souris

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

La maladie d&#39;Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est pathologiquement caractérisée par un dépôt extracellulaire de β-amyloïde de peptide (Aß) et l&#39;accumulation intraneuronale de protéines tau hyperphosphorylée. Parce que le liquide céphalorachidien (LCR) est en contact direct avec l&#39;espace extracellulaire du cerveau, il fournit un reflet des changements biochimiques dans le cerveau en réponse à des processus pathologiques. LCR de patients atteints de MA montre une baisse dans les 42 acides aminés sous forme de Aß (Aß42), et augmente au total tau et hyperphosphorylée tau, bien que les mécanismes responsables de ces changements ne sont pas encore entièrement compris. Modèles de souris transgéniques (Tg) de AD offrent une excellente occasion d&#39;examiner comment et pourquoi les niveaux de Aß ou de tau dans le LCR changements que la maladie progresse. Ici, nous démontrons une technique raffinée cisterna magna perforation pour l&#39;échantillonnage de LCR chez des souris. Cette technique d&#39;échantillonnage très doux permet série LCR d&#39;être obtenu à partir de la même souris à 2-3 mois d&#39;intervalle ce qui minimise considérablement l&#39;effet de confusion entre la souris variabilité des niveaux de Aß ou tau, ce qui permet de détecter de subtiles altérations dans le temps. En combinaison avec Aß et la protéine tau ELISA, cette technique sera utile pour des études visant à étudier la relation entre les niveaux de CSF Aß42 et tau, et leur métabolisme dans le cerveau de souris modèles AD. Des études chez des souris Tg pourrait fournir une validation importante que le potentiel de Aßi LCR ou les niveaux de tau d&#39;être utilisés comme marqueurs biologiques pour la surveillance progression de la maladie, et de surveiller les effets des interventions thérapeutiques. Comme les souris peuvent être sacrifiés et les cerveaux peuvent être examinés pour des changements biochimiques ou histologiques, les mécanismes sous-jacents aux changements CSF peut être mieux évaluée. Ces données sont susceptibles d&#39;être instructive pour l&#39;interprétation des changements humains LCR AD.

Modèles de souris transgéniques (Tg) de AD offrent une excellente occasion d&#39;examiner comment et pourquoi les niveaux de Aß ou de tau dans le LCR changements que la maladie progresse chez les patients humains. Ici, nous démontrons une technique raffinée cisterna magna perforation pour l&#39;échantillonnage CSF de série de la souris.

Une technique de recueil de série du liquide céphalorachidien de la grande citerne de souris

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive qui se caractérise pathologiquement par le dépôt extracellulaire de &#946;-amyloïde...

La procédure commence par l'anesthésie de la souris et la préparation du site chirurgical. La souris est ensuite placée en position ventrale sur l'instrument stéréotaxique. Une incision sagittale de la peau est réalisée en dessous de l'occiput, et les tissus sous-cutanés ainsi que les muscles du cou sont écartés par dissociation contondante le long de la ligne médiane.Ensuite, la partie postérieure du corps est positionnée de manière à former un angle de 135 degrés entre le corps et la tête fixée ; la dure-mère au niveau du grand sternum du CI est pénétrée à l’aide d’une micropipette en verre et le LCR est prélevé. Après le prélèvement du LCR, les muscles sont réalignés et la peau est suturée ; environ un millilitre de solution saline à 0,9 % NACL est injecté par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation, et la souris est maintenue au chaud jusqu’à son réveil. Bonjour, je m’appelle Liu, je travaille au laboratoire de la Dre Karen Duff au Top Institute de l’Université Columbia.Aujourd'hui, je vais vous montrer comment prélever le liquide céphalorachidien du cisternum magna de la souris. Grâce à cette technique, nous pouvons prélever des échantillons sériés de LCR jusqu'à tro

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Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Joshi, K., et al. Approche chirurgicale stéréotaxique pour micro-injecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la citerne grande chez la souris. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo démontre l’approche stéréotaxique de la citerne magna pour une administration ciblée au tronc cérébral et à la moelle épinière supérieure. En accédant à la citerne magna remplie de liquide céphalo-rachidien, cette approche permet des injections précises dans des zones difficiles...

Approche stéréotaxique de la citerne magna pour l’administration thérapeutique dans un modèle murin

Source : Zamboni, M., et al., Induction de la modification des cellules leptoméningées par injection intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la procédure d’administration d’un médicament inducteur dans la citerne magna d’une souris anesthésiée. L’injection induit sélectivement l’expression de marqueurs fluorescents dans les cellules de surface du cerveau accessibles via le liquide céphalo-rachidien, confirmée par l’imagerie par fluorescence.

Administration ciblée de médicament dans un modèle murin par injection de citerne magna

Source : Xavier, A. L. R., et al. Implantation de canule dans la citerne des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018)Cette vidéo montre la procédure d’implantation d’une canule dans la citerne géante d’une souris anesthésiée. La technique consiste à guider une canule montée sur l’aiguille à travers la dure-mère dans la citerne triangulaire inversée magna et à la fixer pour une administration ciblée dans le liquide céphalo-rachidien.

Implantation d’une canule dans la citerne magna dans un modèle murin

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’administration de cellules tumorales dérivées de l’homme dans la citerne magna du cerveau d’une souris. Le modèle murin orthotopique peut être utilisé pour étudier la propagation métastatique du cancer aux méninges crâniennes.

Injection chirurgicale de citerne magna : une méthode d’administration de cellules tumorales directement dans le système nerveux central d’un modèle murin

Source : Sweeney, A. M., et al. Imagerie in vivo du transport du liquide céphalo-rachidien à travers le crâne de souris intact à l’aide de la macroscopie à fluorescence. (2019)Cette vidéo démontre le processus de visualisation de l’écoulement du liquide céphalo-rachidien (LCR) dans le cerveau d’une souris à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Un traceur fluorescent est injecté dans la citerne géante (CM), ce qui permet de suivre son mouvement avec le LCR à travers les espaces...

Imagerie in vivo du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cerveau d’une souris à l’aide de la macroscopie à fluorescence

Ce protocole décrit une technique améliorée pour la collection abondante de liquide céphalo-rachidien (LCR) sans la contamination du sang. Avec une plus grande collecte d’échantillons et de la pureté, des analyses plus peuvent être effectuées à l’aide de CSF pour faire avancer notre compréhension des maladies qui affectent le cerveau et la moelle épinière.

Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés

Nous décrivons ici un protocole pour effectuer une canulation cisterna magna (MCC), une façon mini-invasive pour livrer les traceurs, les substrats et les molécules de signalisation dans le liquide céphalo-rachidien (LCR). Combiné avec différentes modalités d’imagerie, CMc permet glymphatic système et évaluation dynamique CSF, ainsi que livraison de cerveau à l’échelle des divers composés.

Implantation de la canule dans la Magna de Cisterna de rongeurs

L'imagerie optique transcrânienne permet l'imagerie à large champ du transport du liquide céphalo-rachidien dans le cortex des souris vivantes à travers un crâne intact.

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy In Vivo

Les niveaux élevés de protéine de fluide spinal peuvent être le résultat de la diffusion de la protéine de plasma à travers une barrière hémato-encéphalique altérée ou la synthèse intrathécale. Un protocole d'essai optimisé est présenté dans cet article qui aide à discriminer les deux cas et fournit des mesures quantitatives des protéines synthétisées intrathécally.

Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

La chirurgie stéréotaxique pour cibler les sites cérébraux chez la souris implique généralement un accès par les os du crâne et est guidée par des repères du crâne. Nous décrivons ici une approche stéréotaxique alternative pour cibler le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la cisterna magna qui repose sur la visualisation directe des repères du tronc cérébral.

Approche chirurgicale stéréotaxique pour microinjecter le tronc cérébral caudal et la moelle épinière cervicale supérieure via la Cisterna Magna chez la souris

Ici, un protocole est présenté pour évaluer les vaisseaux lymphatiques méningés (MLV) de la souris, qui jouent un rôle important dans de multiples maladies neurologiques. L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode intégrée permettant à la fois l’évaluation fonctionnelle du drainage des traceurs et la caractérisation morphologique détaillée du réseau dorsal des MLV.

Protocole intégré pour l’évaluation des lymphatiques méningées : injection de cisterna magna, imagerie des ganglions lymphatiques, dissection méningée et coloration totale

Découvrez une technique de ponction du liquide céphalorachidien chez la souris transgénique modèle de la maladie d'Alzheimer. Cette méthode permet un prélèvement en série pour suivre l'évolution des biomarqueurs Aβ et tau.

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