Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)

Cette procédure commence par l'isolement des ganglions sympathiques cervicaux supérieurs de rats néonatals âgés de P zéro. Chaque cerveau possède deux ganglions sympathiques cervicaux supérieurs. Environ 24 ganglions peuvent être récoltés à partir d'une seule portée de ratons.

La dissociation des ganglions commence par des trempes et un traitement de 30 minutes. Une dissociation supplémentaire est réalisée par des passages répétés à l’aide d’une pipette en verre polie à la flamme, conduisant à une suspension monocellulaire. Les neurones sympathiques sont ensuite ensemencés sur des boîtes recouvertes de collagène ENC.

Bonjour, je suis Nila Zurin du laboratoire du Dr Lloyd Green, du Département de pathologie et de biologie cellulaire de l'Université Columbia. Aujourd'hui, nous allons démontrer comment isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de jeunes souris rousses. Dans notre laboratoire, nous utilisons généralement ces cellules pour étudier l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux.

Commençons. Nous débutons la procédure en recouvrant une boîte de culture de collagène de queue de rat 24 heures avant de réaliser la dissection. Selon la nature de l'expérience, une plaque de culture de 24 ou 48 puits est utilisée.

Les solutions, milieux et équipements suivants seront préparés. Ces matériaux et réactifs sont décrits dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Il est important de noter que la solution d'uridine et de 5-FDU doit être préparée juste avant utilisation.

Poursuivez la préparation à l’aide de la flamme. Polissez les pipettes en verre pour les étapes de manipulation. Tenez l’extrémité de la pipette en verre dans la flamme pendant quelques secondes tout en la faisant tourner afin de l’amincir et de la lisser.

Le polissage initial par flamme doit être effectué dans une hotte stérile de culture cellulaire. Pour commencer la dissection, récupérez des rats nouveau-nés de P zéro à P un. Un rat nouveau-né est rapidement essuyé avec de l'éthanol à 70 % pour réduire la contamination.

Après la décapitation, la tête est placée sur le tampon de dissection avec la face ventrale vers le haut et l'extrémité caudale orientée vers vous. La trachée sectionnée doit être facilement visible. Des aiguilles stériles de seringue sont utilisées pour fixer la tête sectionnée au tampon de dissection de la manière suivante.

Enfiler une épingle à travers le toit de la bouche dans le bloc et insérer la deuxième épingle à travers la moelle épinière sectionnée dans le bloc. Après avoir déplacé le bloc de dissection sous le microscope et regardé à travers les oculaires, utiliser deux paires de pinces pour retirer la peau et la graisse autour de la trachée. En prenant soin de ne pas aller trop profondément, une paire de muscles presque parallèles l'un à l'autre apparaîtra de chaque côté de la trachée.

Pendant la dissection, il faudra irriguer avec du PBS stérile froid ou du milieu RPMI 1640 sans sérum, également froid, délivré à l’aide d’une pipette Pasteur stérile afin d’éliminer l’excès de sang. Cette étape peut être effectuée une fois ou plusieurs fois, selon la rapidité du travail. Les ciseaux sont ensuite utilisés pour couper et retirer le muscle d’un côté en premier.

Une fois que le muscle est retiré, l'artère carotide devient visible. Cette artère longe la trachée et se divise en une structure qui ressemble à un ruban en forme de Y. Cette bifurcation constitue un repère important, et une fois localisée, il sera relativement facile de trouver les ganglions cervicaux supérieurs.

L'artère est sectionnée à son extrémité la plus proximale et légèrement soulevée avec la pince. L'autre extrémité de l'artère reste attachée. Une fois cette étape terminée, le ganglion cervical supérieur devient visible.

On doit observer une masse tissulaire petite, luisante, de forme ovale, faiblement attachée à l'artère au niveau de la bifurcation, et possédant des prolongements pré- et/ou post-ganglionnaires filamenteux. Une seconde paire de forceps est utilisée pour détacher délicatement le ganglion cervical supérieur et le placer dans une petite boîte de culture de 35 millimètres contenant un milieu RPMI 1640 sans sérum, refroidi. Ensuite, le ganglion est extrait de l'autre côté de la trachée en suivant le même protocole.

Une fois que tous les ganglions ont été disséqués, ils sont débarrassés autant que possible des tissus superflus. En observant au microscope, on peut remarquer que des fragments de tissu adipeux de l'artère carotide ou d'autres tissus sont encore attachés aux ganglions ; des pinces sont alors utilisées pour enlever ces matériaux indésirables. Les connectifs pré- et/ou post-ganglionaires sont également sectionnés.

Chaque ganglion contient environ 10 000 neurones. Une fois les neurones ensemencés, ils régénéreront leurs neurites. Les ganglions sont ensuite placés dans un tube conique stérile de 15 millilitres en polypropylène contenant du milieu RPMI 1640.

Ensuite, la culture de neurones sympathiques est établie. Les ganglions sont centrifugés à 200 g pendant deux minutes et le surnageant est éliminé. Les ganglions sont resuspendus dans 0,5 à un millilitre de solution de trypsine 0,25 %, puis placés dans un bain-marie ou une étuve à 37 °C pendant 30 minutes afin de faciliter la dissociation des cellules au sein des ganglions.

Après 30 minutes, 10 millilitres de milieu complet sont ajoutés afin de diluer et neutraliser la trypsine. Les solutions sont ensuite centrifugées à 200 ×g pendant deux minutes. Le surnageant est ensuite éliminé et les ganglions sont resuspendus dans deux millilitres de milieu final.

À l’aide de l’une des pipettes préparées avec une ouverture large et polie à la flamme, les cellules sont davantage dissociées en aspirant et expulsant les ganglions 20 fois. Le tube est ensuite placé sur de la glace pendant quelques minutes. Ensuite, la pipette est à nouveau polie à la flamme pour rendre l’ouverture encore plus étroite.

Après refroidissement de la pipette, les ganglions sont triturés encore 20 fois. Le milieu deviendra progressivement plus trouble, indiquant que les cellules se dissocient. Cette étape est répétée une ou deux fois supplémentaires selon la facilité avec laquelle les cellules se dissocient.

Après un certain temps, les ganglions se seront dissociés en neurones et aucun ganglion intact ne sera visible dans le tube. Il peut subsister certains matériaux tissulaires qui ne se seront pas dissociés à ce stade. On laisse le tube reposer sur de la glace pendant quelques minutes afin que les débris non associés puissent sédimenter au fond.

Tout le surnageant sauf environ 50 microlitres est soigneusement prélevé et placé dans un autre tube. On laisse 50 microlitres au fond du tube afin d'éviter le transfert des débris non associés. On ajoute davantage de milieu final au tube contenant les cellules dissociées.

Le volume de milieu final ajouté dépend du type de plaque de culture utilisé pour cultiver les neurones. Par exemple, si une plaque de 24 puits est utilisée, alors on met un ganglion par puits dans 0,5 millilitre de milieu final par puits.

Une portée typique de rat comprend 12 petits, ce qui donne 24 ganglions. Cela suffit pour ensemencer une plaque 24 puits, et le volume total du milieu final est de 12 millilitres. L'utilisation d'uridine cinq FDU dans le milieu final empêchera la prolifération et favorisera la mort d'une petite population de cellules gliales et d'autres types cellulaires.

Présents dans la culture, les cellules sont nourries toutes les 48 heures en remplaçant les deux tiers du milieu par du RPMI frais additionné de 1 % de sérum de cheval, de NGF, d'uridine et de cinq FDU. Au départ, la culture contient des neurones sympathiques ayant une apparence ronde, sans prolongements neuronaux.

Les neurones courts deviennent visibles 24 heures après la dissection et s'épaississent progressivement tout en se ramifiant davantage au fil du temps. Nous venons de vous montrer comment isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de rats nouveau-nés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler premièrement de prendre le temps de bien nettoyer les ganglions, en éliminant tous les débris, vaisseaux sanguins et tissus adipeux.

Cette étape est importante pour garantir une culture plus ou moins homogène et dépourvue de types cellulaires étrangers. Deuxièmement, pendant l'étape de dissociation, soyez patient et prenez le temps de séparer les neurones afin qu'ils ne se retrouvent pas en gros agrégats. Une fois déposés sur les plaques, les gros agrégats poseront des difficultés.

Dans les applications en aval, telles que la section ou l'infection des neurones, la coloration immunohistochimique peut également être entravée, et toutes les expériences nécessitant le comptage des neurones seront difficiles à réaliser également. Enfin, il n'est pas nécessaire de supplémenter le milieu avec de la pénicilline-streptomycine. Chaque fois que les cultures sont nourries, l'ajout de pénicilline-streptomycine n'est nécessaire qu'au moment du premier repiquage des cellules.

Ajoutez de l'uridine cinq FDU fraîche au milieu à chaque changement de milieu. Notre laboratoire a utilisé la culture de neurones sympathiques pour étudier l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.