Name: Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de rats nouveau-nés. Cette méthode permet d'étudier le comportement neuronal et l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux.

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NZ tiens à remercier les membres du laboratoire Subhas Biswas, Andrew Sproul, et Ryan Willet pour sa formation en disséquant et la récolte neurones sympathiques. Soutenu par des subventions du NIH-NINDS.

1. Préparation à la dissection: <ol><li> Sélectionnez la boîte de culture approprié (10 cm ou des plaques 6 puits ou 24 puits, etc) selon la nature de vos expériences, et les enduire de collagène de queue de rat 24 heures avant la dissection. Les méthodes de préparation de collagène de queue de rat et l&#39;utiliser pour des boîtes de culture manteau ont été décrites ailleurs (1). </li><li> Préparer une solution de trypsine à 0,25% en tampon phosphate salin (PBS) (sans EDTA) et stériliser par filtration. Préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer une solution contenant 2,5 mM de chacun des uridine et de 5-FDU dans l&#39;eau distillée / désionisée H 2 O. Filtre-stériliser et préparer 50 aliquotes. Entreposer à -20 º C. </li><li> Préparer le milieu complet: milieu de culture RPMI 1640 avec inactivés par la chaleur de 10% de sérum de cheval (chaleur inactiver en incubant dans un bain-marie 56 º C pendant 30 minutes) et 5% de sérum fœtal bovin. </li><li> Préparer milieu final: milieu de culture RPMI 1640 avec inactivés par la chaleur de 1% de sérum de cheval + NGF (100ηg/ml concentration finale) + pénicilline / streptomycine (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solution (concentration de 10 uM final) . Remarque: ce moyen doit être constitué fraîches avant de les utiliser à chaque fois. Pour une expérience dans un format de plaque de 24 puits, on aura besoin pour préparer 12 ml de ce milieu. Il est recommandé de préparer un petit supplément. NGF peuvent être achetés auprès de diverses sources commerciales (voir le tableau à la fin de ce protocole). </li><li> Equipement: Un besoin d&#39;une loupe binoculaire et la source lumineuse. Un illuminateur col de cygne double fibre optique avec des conseils au point est préféré. En outre, on aura besoin pour nettoyer et stériliser (par autoclavage ou par trempage dans de l&#39;éthanol 70% pendant au moins 20 minutes) les outils de dissection suivante: deux paires de pinces à disséquer les micro-acier inoxydable, et une paire de ciseaux de dissection (également en acier inoxydable et de deux de Roboz). Deux aiguilles de seringues stériles (26 x gague 1 ½ pouces ou similaire) seront également nécessaires. Il est nécessaire de mettre en place un conseil de dissection, qui est un 3 &quot;x3&quot; morceau de styromousse enveloppé dans du papier aluminium et recouvert d&#39;une Kimwipe. Vaporiser le conseil d&#39;éthanol à 70% pour décontaminer. Enfin, préparer un feu poli pipette en verre pâturages. Afin de feu polonais, prendre la pipette en verre et maintenez la pointe de la flamme pendant quelques secondes, tout en tournant. Lors de l&#39;inspection, la pointe sera un aspect plus lisse et l&#39;ouverture sera plus étroite. Cela est nécessaire pour l&#39;étape où les cellules seront dissociées. Effectuer poli-feu dans une hotte de culture cellulaire de telle sorte que la pipette reste stérile. </li></ol> 2. La dissection de ganglions cervicaux Supérieur: <ol><li> Recueillir les ratons nouveau-nés qui sont en âge de P0 ou P1. </li><li> Rapidement essuyez le chiot pour la dissection à l&#39;éthanol 70% pour réduire les risques de contamination. </li><li> Rapidement décapiter chiot avec une paire de ciseaux (cette étape ne sera pas montré dans la vidéo). Tenir la tête à l&#39;aide des pinces stériles de gaze stérile contre les égoutter brièvement excès de sang. </li><li> Placez la tête sur le pavé de dissection avec la face ventrale vers le haut et l&#39;extrémité caudale orientée vers vous. La trachée coupée doit être facilement visible. Utiliser les aiguilles de seringues stériles pour sécuriser la tête coupée au pad dissection de la manière suivante: pousser une broche si le toit de la bouche dans le pad et poussez la seconde broche si la trachée coupée dans le coussinet. Placez le coussin sous le microscope de dissection et de commencer la dissection. </li><li> En utilisant les deux pinces (une dans chaque main) la peau claire loin et de graisse autour de la trachée, en prenant soin de ne pas aller trop profond. Faire cela va exposer une paire de muscles courant presque parallèlement les uns aux autres de chaque côté de la trachée. Remarque: lors de la dissection, vous aurez besoin d&#39;irriguer avec du PBS stérile à froid ou à froid, sans sérum du milieu RPMI 1640 livré avec une pipette stérile, Pasteur pour laver l&#39;excès de sang et de garder l&#39;endroit propre et humide. Cela peut être fait qu&#39;une seule fois ou plusieurs fois selon la vitesse on travaille. Pour un dissecteur expérience, il ne prend que deux à trois minutes de disséquer une paire de ganglions. </li><li> Utilisez la pince pour couper et enlever le muscle d&#39;un côté d&#39;abord. </li><li> Une fois que le muscle est enlevé, l&#39;artère carotide deviendra visible. Souvent, il est léger rosé et contient du sang. Il peut apparaître plus clair que d&#39;autres vaisseaux sanguins que vous pouvez voir dans les environs et pour cette raison l&#39;artère carotide ne peut pas être perceptible immédiatement. Cette artère longe la trachée et se divise en ce qui ressemble à un &quot;Y&quot; en forme de ruban. Cette bifurcation est un jalon important et une fois il se trouve, il sera relativement facile de trouver la CTB. </li><li> Sever de l&#39;artère à l&#39;extrémité la plus caudale et soulevez-le légèrement avec la pince (l&#39;autre extrémité est encore attaché). Une fois que vous faites cela, vous verrez une forme d&#39;amande, brillant de masse à la recherche de tissu qui est lâchement à l&#39;artère juste au point de bifurcation et qui a thread-comme pré-et / ou post-ganglionnaires connectifs. C&#39;est le ganglion cervical supérieur. Utilisez une deuxième paire de pince dans l&#39;autre main au détachez qu&#39;elle et sa place dans une boîte de culture de petite taille (35 mm) contenant le froid, sans sérum du milieu RPMI 1640. </li><li> Ensuite, extraire le ganglion de l&#39;autre côté de la trachée suivant le même protocole. </li></ol> 3. Nettoyage les ganglions: <ol><li> Une fois que tous les ganglions ont été disséquées, ils devraient être libérés, autant que possible des tissus étrangers. </li><li> Sous le microscope de dissection, vous pouvez voir que les ganglions ont attaché des morceaux de l&#39;artère carotide, le tissu adipeux ou autres. Travailler avec une pince dans chaque main pour taquiner l&#39;écart de ces matières indésirables. Placez nettoyé ganglions dans une stérile conique 15ml, tube en polypropylène, contenant du milieu RPMI 1640. </li><li> Les connecteurs pré-et / ou post-ganglionnaires doivent également être coupé. Chaque ganglion a environ 10.000 neurones. Une fois que les neurones sont plaqués, ils vont repousser leurs neurites. </li></ol> 4. Établir la culture des neurones sympathiques: <ol><li> Centrifuger les ganglions au 200xg pendant 2 minutes et jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre les ganglions de 0,5 à 1 ml de solution de trypsine à 0,25%. Placer dans un bain-marie 37 ˚ C ou un incubateur pendant 30 minutes. Cela aidera à dissocier les cellules dans les ganglions. </li><li> Après 30 minutes, ajouter 10 ml de milieu complet pour diluer et neutraliser la trypsine et centrifuger à 200xg pendant 2 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu final. </li><li> De plus dissocier les cellules par trituration des ganglions de haut en bas avec le feu-pipette en verre poli pâturage. Triturer les ganglions 20 fois et placer le tube sur la glace pendant quelques minutes. </li><li> Pendant ce temps, le feu-polonais le plus pipette pour faire l&#39;ouverture étroite (environ 2 / 3-1 / 2 mm de diamètre). Attendez quelques minutes jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se refroidit et se triturer les ganglions 20 fois plus. Comme vous continuez, le milieu devient progressivement plus nuageux en indiquant que les cellules sont dissociées. Répétez cette étape une ou deux fois plus en fonction de la façon dont les cellules se dissocient. Après quelque temps, vous remarquerez que tous les ganglions sont dissociés en neurones et aucun ganglions intacts sont visibles dans le tube. Il peut y avoir du matériel tissulaire qui se dissocient pas. À ce stade, laissez reposer le tube dans la glace pendant quelques minutes afin que tous les débris non dissocié peut se déposent au fond. Maintenant recueillir soigneusement la quasi-totalité du milieu du haut et les placer dans un autre tube. Afin de s&#39;assurer que vous ne percevez pas les débris non dissocié, laissez environ 50 ul au fond du tube. Ajouter plus de la moyenne finale au tube contenant des cellules dissociées: ce volume dépend du type de culture est une plaque à l&#39;aide à la culture des neurones. Par exemple: si un plat de 24 puits doit être employé, puis la plaque 0,5 ganglions par puits (~ 10 000 neurones par puits) dans 0,5 ml de milieu final par puits. Une portée de rats typique se compose de 12 petits, ce qui donnerait 24 ganglions. Cela est suffisant pour un 24 graines bien-plaque et le volume total du milieu final est de 12 ml. Note: les ganglions contiennent également une petite population de cellules gliales et les autres types de cellules qui seront présents dans la culture. Utiliser Uridine/5-FDU dans le milieu final permettra d&#39;éviter leur prolifération et de promouvoir leur mort. </li><li> Flux cellules toutes les 48 heures en remplaçant 2 / 3 de la moyenne avec RPMI frais 1% de sérum de cheval + NGF et uridine/5-FDU. Remarque: Dans un premier temps, la culture contient des neurones sympathiques qui ont l&#39;air pas rond avec neurites. Neurites courts deviennent visibles 24 heures après la dissection et deviennent progressivement plus dense et plus ramifiée au cours du temps. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Nous utilisons des rats Sprague-Dawley pour nos cultures. Prenez le temps et les soins lors du nettoyage des ganglions. Enlever tous les débris, les vaisseaux sanguins et de graisse. Cette étape est importante pour assurer une culture qui est plus ou moins homogènes et de types de cellules étrangères. L&#39;ajout de uridine/5-FDU éliminera largement toutes les cellules restantes non-neuronales (mitose) contaminent la culture ou au moins supprimer leur prolifération. En outre, durant l&#39;étape de dissociation, être patient ...

<table><tbody><tr><td>Pinces, acier inoxydable n°5</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux, DEAVER droits à extrémités pointues et tranchantes - lames de 43 mm - 5,5</td><td>Outil</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec L-glutamine</td><td>Réactif</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Réactif</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval donneur</td><td>Réactif</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Inactiver par chaleur en incubant dans un bain-marie à 56&amp;#x00B0;C pendant 30 minutes.</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Réactif</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine sans EDTA</td><td>Réactif</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo;-désoxyuridine</td><td>Réactif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Réactif</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de dissection et source lumineuse</td><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes polypropylène de 15 ml</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire</td><td>Outil</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour les neurones sympathiques de rat culture ganglions cervicaux supérieur (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

Les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) chez les rats sont petites, brillant, en forme d&#39;amande structures qui contiennent des neurones sympathiques. Ces neurones fournissent innervations sympathiques pour la tête et du cou et ils constituent une population bien caractérisés et relativement homogène (4). Neurones sympathiques sont tributaires du facteur de croissance nerveuse (NGF) pour la croissance de survie, la différenciation et axonale et la généralisation de la disponibilité du NGF facilite leur culture et leur manipulation expérimentale (2, 3, 6). Pour ces raisons, des cultures de neurones sympathiques ont été utilisés dans un large éventail d&#39;études, y compris le développement neuronal et la différenciation, les mécanismes de mort cellulaire programmée et pathologiques, et la transduction du signal (1, 2, 5 et 6). Disséquer la CTB à partir de rats nouveau-nés et les neurones sympathiques en culture n&#39;est pas très compliqué et peut être maîtrisé assez rapidement. Dans cet article, nous allons décrire en détail comment disséquer la CTB de ratons nouveau-nés et à les utiliser pour établir des cultures de neurones sympathiques. L&#39;article décrit également les étapes préparatoires et les différents réactifs et du matériel qui sont nécessaires pour atteindre cet objectif.

C&#39;est un protocole décrivant la façon d&#39;isoler et de culture primaire de neurones sympathiques des ganglions cervicaux supérieurs (GCS) de ratons nouveau-né.

Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)

Les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) chez le rat sont de petites structures luisantes en forme d'amande qui contiennent des neurones sympathiques. Ces neurones assurent...

Cette procédure commence par l'isolement des ganglions sympathiques cervicaux supérieurs de rats néonatals âgés de P zéro. Chaque cerveau possède deux ganglions sympathiques cervicaux supérieurs. Environ 24 ganglions peuvent être récoltés à partir d'une seule portée de ratons.La dissociation des ganglions commence par des trempes et un traitement de 30 minutes. Une dissociation supplémentaire est réalisée par des passages répétés à l’aide d’une pipette en verre polie à la flamme, conduisant à une suspension monocellulaire. Les neurones sympathiques sont ensuite ensemencés sur des boîtes recouvertes de collagène ENC.Bonjour, je suis Nila Zurin du laboratoire du Dr Lloyd Green, du Département de pathologie et de biologie cellulaire de l'Université Columbia. Aujourd'hui, nous allons démontrer comment isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de jeunes souris rousses. Dans notre laboratoire, nous utilisons généralement ces cellules pour étudier l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux.Commençons. Nous débutons la procédure en recouvrant une boîte de culture de collagène de queue de rat 24 heures avant de réaliser la dissection. Selon la nature de l'expérience, une plaque de culture de 24 ou 48 puits est utilisée.Les solutions, milieux et équipements suivants seront préparés. Ces matériaux et réactifs sont décrits dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo. Il est important de noter que la solution d'uridine et de 5-FDU doit être préparée juste avant utilisation.Poursuivez la préparation à l’aide de la flamme. Polissez les pipettes en verre pour les étapes de manipulation. Tenez l’extrémité de la pipette en verre dans la flamme pendant quelques secondes tout en la faisant tourner afin de l’amincir et de la lisser.Le polissage initial par flamme doit être effectué dans une hotte stérile de culture cellulaire. Pour commencer la dissection, récupérez des rats nouveau-nés de P zéro à P un. Un rat nouveau-né est rapidement essuyé avec de l'éthanol à 70 % pour réduire la contamination.Après la décapitation, la tête est placée sur le tampon de dissection avec la face ventrale vers le haut et l'extrémité caudale orientée vers vous. La trachée sectionnée doit être facilement visible. Des aiguilles stériles de seringue sont utilisées pour fixer la tête sectionnée au tampon de dissection de la manière suivante.Enfiler une épingle à travers le toit de la bouche dans le bloc et insérer la deuxième épingle à travers la moelle épinière sectionnée dans le bloc. Après avoir déplacé le bloc de dissection sous le microscope et regardé à travers les oculaires, utiliser deux paires de pinces pour retirer la peau et la graisse autour de la trachée. En prenant soin de ne pas aller trop profondément, une paire de muscles presque parallèles l'un à l'autre apparaîtra de chaque côté de la trachée.Pendant la dissection, il faudra irriguer avec du PBS stérile froid ou du milieu RPMI 1640 sans sérum, également froid, délivré à l’aide d’une pipette Pasteur stérile afin d’éliminer l’excès de sang. Cette étape peut être effectuée une fois ou plusieurs fois, selon la rapidité du travail. Les ciseaux sont ensuite utilisés pour couper et retirer le muscle d’un côté en premier.Une fois que le muscle est retiré, l'artère carotide devient visible. Cette artère longe la trachée et se divise en une structure qui ressemble à un ruban en forme de Y. Cette bifurcation constitue un repère important, et une fois localisée, il sera relativement facile de trouver les ganglions cervicaux supérieurs.L'artère est sectionnée à son extrémité la plus proximale et légèrement soulevée avec la pince. L'autre extrémité de l'artère reste attachée. Une fois cette étape terminée, le ganglion cervical supérieur devient visible.On doit observer une masse tissulaire petite, luisante, de forme ovale, faiblement attachée à l'artère au niveau de la bifurcation, et possédant des prolongements pré- et/ou post-ganglionnaires filamenteux. Une seconde paire de forceps est utilisée pour détacher délicatement le ganglion cervical supérieur et le placer dans une petite boîte de culture de 35 millimètres contenant un milieu RPMI 1640 sans sérum, refroidi. Ensuite, le ganglion est extrait de l'autre côté de la trachée en suivant le même protocole.Une fois que tous les ganglions ont été disséqués, ils sont débarrassés autant que possible des tissus superflus. En observant au microscope, on peut remarquer que des fragments de tissu adipeux de l'artère carotide ou d'autres tissus sont encore attachés aux ganglions ; des pinces sont alors utilisées pour enlever ces matériaux indésirables. Les connectifs pré- et/ou post-ganglionaires sont également sectionnés.Chaque ganglion contient environ 10 000 neurones. Une fois les neurones ensemencés, ils régénéreront leurs neurites. Les ganglions sont ensuite placés dans un tube conique stérile de 15 millilitres en polypropylène contenant du milieu RPMI 1640.Ensuite, la culture de neurones sympathiques est établie. Les ganglions sont centrifugés à 200 g pendant deux minutes et le surnageant est éliminé. Les ganglions sont resuspendus dans 0,5 à un millilitre de solution de trypsine 0,25 %, puis placés dans un bain-marie ou une étuve à 37 °C pendant 30 minutes afin de faciliter la dissociation des cellules au sein des ganglions.Après 30 minutes, 10 millilitres de milieu complet sont ajoutés afin de diluer et neutraliser la trypsine. Les solutions sont ensuite centrifugées à 200 ×g pendant deux minutes. Le surnageant est ensuite éliminé et les ganglions sont resuspendus dans deux millilitres de milieu final.À l’aide de l’une des pipettes préparées avec une ouverture large et polie à la flamme, les cellules sont davantage dissociées en aspirant et expulsant les ganglions 20 fois. Le tube est ensuite placé sur de la glace pendant quelques minutes. Ensuite, la pipette est à nouveau polie à la flamme pour rendre l’ouverture encore plus étroite.Après refroidissement de la pipette, les ganglions sont triturés encore 20 fois. Le milieu deviendra progressivement plus trouble, indiquant que les cellules se dissocient. Cette étape est répétée une ou deux fois supplémentaires selon la facilité avec laquelle les cellules se dissocient.Après un certain temps, les ganglions se seront dissociés en neurones et aucun ganglion intact ne sera visible dans le tube. Il peut subsister certains matériaux tissulaires qui ne se seront pas dissociés à ce stade. On laisse le tube reposer sur de la glace pendant quelques minutes afin que les débris non associés puissent sédimenter au fond.Tout le surnageant sauf environ 50 microlitres est soigneusement prélevé et placé dans un autre tube. On laisse 50 microlitres au fond du tube afin d'éviter le transfert des débris non associés. On ajoute davantage de milieu final au tube contenant les cellules dissociées.Le volume de milieu final ajouté dépend du type de plaque de culture utilisé pour cultiver les neurones. Par exemple, si une plaque de 24 puits est utilisée, alors on met un ganglion par puits dans 0,5 millilitre de milieu final par puits.Une portée typique de rat comprend 12 petits, ce qui donne 24 ganglions. Cela suffit pour ensemencer une plaque 24 puits, et le volume total du milieu final est de 12 millilitres. L'utilisation d'uridine cinq FDU dans le milieu final empêchera la prolifération et favorisera la mort d'une petite population de cellules gliales et d'autres types cellulaires.Présents dans la culture, les cellules sont nourries toutes les 48 heures en remplaçant les deux tiers du milieu par du RPMI frais additionné de 1 % de sérum de cheval, de NGF, d'uridine et de cinq FDU. Au départ, la culture contient des neurones sympathiques ayant une apparence ronde, sans prolongements neuronaux.Les neurones courts deviennent visibles 24 heures après la dissection et s'épaississent progressivement tout en se ramifiant davantage au fil du temps. Nous venons de vous montrer comment isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de rats nouveau-nés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler premièrement de prendre le temps de bien nettoyer les ganglions, en éliminant tous les débris, vaisseaux sanguins et tissus adipeux.Cette étape est importante pour garantir une culture plus ou moins homogène et dépourvue de types cellulaires étrangers. Deuxièmement, pendant l'étape de dissociation, soyez patient et prenez le temps de séparer les neurones afin qu'ils ne se retrouvent pas en gros agrégats. Une fois déposés sur les plaques, les gros agrégats poseront des difficultés.Dans les applications en aval, telles que la section ou l'infection des neurones, la coloration immunohistochimique peut également être entravée, et toutes les expériences nécessitant le comptage des neurones seront difficiles à réaliser également. Enfin, il n'est pas nécessaire de supplémenter le milieu avec de la pénicilline-streptomycine. Chaque fois que les cultures sont nourries, l'ajout de pénicilline-streptomycine n'est nécessaire qu'au moment du premier repiquage des cellules.Ajoutez de l'uridine cinq FDU fraîche au milieu à chaque changement de milieu. Notre laboratoire a utilisé la culture de neurones sympathiques pour étudier l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux. Voilà donc tout.Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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Biology

Biologie

Nous décrivons un protocole pour l'utilisation de protéines morphogénétiques osseuses-7 (BMP-7) ou Matrigel pour induire sélectivement la croissance dendritique dans les neurones sympathiques dissociés primaires des ganglions cervicaux supérieurs (SCG) de rats périnatales.

Induire la croissance dendritique dans des cultures de neurones sympathiques

Le protocole décrit un système de modèle efficace et reproductible pour étudier l'herpès simplex virus type 1 (HSV-1) temps de latence et la réactivation. Le dosage utilise des cultures de neurones sympathiques homogènes et permet pour la dissection moléculaire des virus de neurones interactions en utilisant une variété d'outils, y compris l'interférence ARN et d'expression de protéines recombinantes.

Un système de neurones primaires de la culture pour l&#39;étude de l&#39;herpès simplex virus de latence et de réactivation

Cette vidéo montre une procédure permettant d’isoler les neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) à partir d’embryons de rats et de les co-cultiver avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann matures. Les DRG isolés sont traités pour isoler les neurones et les cellules gliales. Les cellules isolées sont cultivées pour purifier les neurones, qui sont ensuite co-cultivés avec des cellules de type cellules de Schwann (SCLC) dans un milieu de co-culture.

Isolement de neurones DRG et coculture avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann

Cette vidéo décrit l’isolement et la culture de cellules de Schwann à partir de racines spinales de souris. Des cellules isolées sont ensuite cultivées dans des milieux spécifiques. Les cellules de Schwann sont isolées par digestion différentielle et par adhérence. Ils sont ensuite transférés sur des lamelles recouvertes d’une matrice extracellulaire pour être fixés et proliférer.

Isolement des cellules de Schwann à partir de racines vertébrales de souris

Cette vidéo montre une technique permettant d’isoler et de cultiver des cellules de ganglions de la racine dorsale (DRG) de la colonne vertébrale du rat. Les DRG excisés de la colonne vertébrale sont traités par des enzymes et dissociés mécaniquement pour obtenir une suspension unicellulaire. Les cellules sont cultivées dans un milieu contenant des inhibiteurs et des facteurs de croissance qui limitent la prolifération des cellules gliales et favorisent la croissance neuronale, respectivement.

Etablissement d’une culture cellulaire de ganglions de la racine dorsale primaire à partir d’une colonne vertébrale de rat

Nous décrivons ici une cellule de Schwann (SC) essai de migration dans lequel SC sont en mesure de développer le long des axones s'étendent.

Analyser murin développement des cellules de Schwann le long des axones en croissance

Ce protocole décrit l’isolement des neurones du ganglion de la racine dorsale (DRG) isolés de rats et la culture de neurones DRG sur un système de culture cellulaire statique pré-étiré pour améliorer l’alignement axonal, avec co-culture ultérieure de cellules de Schwann (SC) pour favoriser la myélinisation.

Une approche pour améliorer l&#39;alignement et myélinisation de ganglion de racine dorsale Neurones

Les cultures primaires (DRG) les ganglions de la racine dorsale sont fréquemment utilisés pour étudier les fonctions physiologiques ou pathologie imprévisibles dans les neurones sensoriels. Ici, nous montrent l’utilisation de cultures DRG lombaires pour détecter la libération de neurotransmetteurs après le type de récepteur de neuropeptide FF 2 stimulation avec un agoniste sélectif.

Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs

Cet article décrit l’isolement et la culture des neurones sympathiques embryonnaires de rat des ganglions cervicals supérieurs. Il fournit également des protocoles détaillés pour la coloration immunocytochimique et pour préparer des extraits neuronaux pour l’analyse spectrométrique de masse.

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonate Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Les ganglions ciliaires de poussin (CG) font partie du système nerveux parasympathique. Les cultures neuronales des neurones de CG de poussin ont été montrées pour être des modèles de cellules efficaces dans l’étude des interactions de muscle nerveux. Nous décrivons un protocole détaillé pour la dissection, la dissociation et la culture in vitro des neurones de CG des embryons de poussin.

Isolement et culture des neurones ganglionnaires de Chick

Le présent protocole décrit un modèle murin de l’ablation de l’innervation adrénergique par identification et réséquence du ganglion cervical supérieur.

Technique chirurgicale pour la ganglionectomie cervicale supérieure dans un modèle murin

Apprenez à isoler et cultiver des neurones sympathiques primaires à partir des ganglions cervicaux supérieurs de rats nouveau-nés. Cette méthode permet d'étudier le comportement neuronal et l'apoptose en réponse au retrait du facteur de croissance nerveux.

Protocole pour les neurones sympathiques de rat Culture ganglions cervicaux supérieur (SCG)

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