Name: Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver les neurones granuleux cérébelleux de souris postnatales. Cette méthode utilise la papaine et un gradient de percoll pour séparer les cellules granuleuses des cellules gliales.

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Nous remercions Barbara Carletti et Anna Marie Kenney pour des suggestions précieuses. HYL est soutenu par les subventions de formation «Hormones: Biochimie et Biologie Moléculaire&quot;, DK07328. Soutenu en partie par NIH NS16951 5R01 (CAM).

Partie 1: Mise en place (1-2 jours avant la dissection) (non représenté sur la vidéo) <ol><li> PREPARATION DE SOLUTIONS DE CULTURE ET MÉDIAS: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcium et magnésium libre-tampon phosphate salin-EDTA pour des dilutions de Percoll): litre, ajouter 32 g de NaCl, 1,2 g de KCl, 8 g de glucose, 2 g de NaH 2 PO 4, 1 g de KH 2 PO 4, 8 ml de 2% de NaHCO 3 actions, 10 ml d&#39;EDTA 1 M (pH 8,0) à l&#39;eau distillée / désionisée. Réglez le volume à 1 litre et le pH à 7,4. Stériliser par filtration. </li><li> HBSS-glucose: glycémie Ajouter (6 grammes / litre) pour le calcium et le magnésium Solution gratuite de Hank équilibre du sel (HBSS) et le filtre stérile. 500 ml peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> MILIEUX DE CULTURE: un milieu sans sérum (SFM) et 10% moyennes FBS. Pour 48 ml d&#39;Neurobasal A-Medium ajouter 500 ul 100X glutamax I, 500 ul 100X pénicilline-streptomycine (100 unités finales pénicilline et la streptomycine 100 ug), 6,25 M de KCl 2 ul (finale 250 pM). Split en deux aliquotes de 9 ml et 40 ml. Pour préparer 10% de FBS moyenne, ajouter 1ml de chaleur FBS inactivé à l&#39;aliquote de 9 ml. Pour préparer l&#39;AFD, ajouter 800 ul du supplément sans sérum B-27 à l&#39;aliquote de 40 ml. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C pour un maximum de 2 semaines. Pour de meilleurs résultats font les médias fraîche pour chaque expérience. </li></ul></li><li> La préparation des dilutions PERCOLL: <ul><li> Percoll est fourni sous forme liquide et il doit être acidifié avant utilisation. Pour préparer le bouillon, ajouter HCl 1N peu à peu à la solution de Percoll sur une période de 1-2 heures jusqu&#39;à un pH de 7,4 est atteint. Ajout de l&#39;HCl trop rapidement provoquera l&#39;Percoll à agréger. Environ 6,5 ml de HCl 1N sont nécessaires pour chaque litre de Percoll. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> A 35% et 60% (vol: vol) de dilution Percoll sera utilisé dans l&#39;étape gradient de Percoll. Préparer 100 ml de Percoll dilutions contenant 35 ou 60 ml de Percoll stock, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA et distillée / désionisée H2O au volume final. Ajouter quelques gouttes de bleu de toluidine à la solution de 60%; elle aider à visualiser l&#39;interface et les cellules. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA ne doivent pas être âgés de plus de trois mois, comme en mémoire tampon inadéquate peut entraîner la mort cellulaire accrue lors de la procédure. </li></ul></li><li> Lamelles PRÉPARATION: lamelles de verre (la meilleure de Carolina Biological Supply Company) sont lavées avec HCl à 10% durant la nuit à température ambiante avec une légère agitation, soigneusement rincées à l&#39;eau distillée / deonized eau et conservés dans l&#39;éthanol à 70%. Avant utilisation, des lamelles simples sont stérilisées à la flamme par un bref en les tenant avec des pinces sur une flamme nue (bec Bunsen) jusqu&#39;à l&#39;évaporation de l&#39;éthanol. Lamelles de verre de 12 mm peuvent être placés dans des plaques de culture à 4 puits et de 25 mm lamelles en plaques de culture 6 puits. </li><li> Des récipients de culture REVÊTEMENT avec le substrat: Pour la coloration immunofluorescence ou des lamelles de verre de drogue traitements sont plus appropriés, car ils peuvent être facilement montés sur lames de verre pour une visualisation sous un microscope. Lorsqu&#39;un grand nombre de cellules nécessaires pour la collecte des échantillons de protéines ou d&#39;ARN, les cellules peuvent être cultivées sur la culture en plastique la nuit offre des plats avant dissection, des lamelles de verre ou de vaisselle en plastique pour la culture doivent être recouvertes de poly-D-lysine (500 pg / ml; 800 ul / puits pour plaques de 6 puits ou 350 l / puits pour les 4-puits). 5 mg / ml de solution concentrée de poly-D-lysine est stocké à -20 ° C, puis dilué dans distillée stérile / deonized l&#39;eau et stérile droite filtrée avant utilisation. Des récipients de culture sont incubées à 37 ° C pendant une nuit (ou au moins pendant 2 heures avant le placage) et lavées deux fois avec le droit de l&#39;eau distillée stérile / deonized avant l&#39;ensemencement. </li><li> La préparation des plats PREPLATING: Ces plats seront utilisés pour le pré-placage des cellules isolées du cervelet avant la culture pour éliminer les contaminants gliales, qui adhèrent plus facilement à une faible concentration de substrat. Manteau deux 60 mm en plastique des boîtes de culture à 4 ml par boîte de poly-D-lysine (100 pg / ml; Notez que ceci est 1 / 5 de la concentration utilisée pour la culture). Incuber à 37 ° C pendant une nuit (ou au moins pendant 2 heures avant dissection). Juste avant la dissection, retirer la solution de poly-D-lysine, laver la vaisselle deux fois avec de l&#39;eau stérile et laisser sécher sous la hotte. </li><li> Stériliser les outils de dissection à l&#39;autoclave ou le jour de la dissection, immerger les outils dans l&#39;éthanol 70% pendant 20 minutes. Outils nécessaires: ciseaux Permaset, ciseaux microdissecting, quatre Dumont # 5 pinces à disséquer. </li></ol> Partie 2: Préparation pour la dissection (jour de la dissection) - (Démonstration en vidéo) Toutes les procédures suivantes sont effectuées dans une hotte de culture de tissus, sauf indication contraire. <ol><li> Essuyez la zone de dissection à l&#39;éthanol 70%. Chaud les médias à 37 ° C dans un bain-marie ou dans un 5% de CO 2 37 ° C incubateur. </li><li> Lors du démarrage d&#39;un nouveau système de dissociation papaïne Kit (Worthington), préparer la solution d&#39;albumine-ovomucoïde inhibiteur. Ajouter 32 mlde EBSS (solution saline équilibrée de Earle; fourni dans le kit) pour le mélange inhibiteur de l&#39;albumine ovomucoïde et permettent de dissoudre le contenu tout en préparant les autres composants. Reconstituer pour la première utilisation, puis stocker le reste de la solution à 2-8 ° C et utiliser jusqu&#39;à cinq isolements permis par chaque kit sont terminées. </li><li> Ajouter 5 ml d&#39;un flacon d&#39;EBSS papaïne du Kit de dissociation (chaque flacon est suffisant pour la dissociation de 4 à 15 jours après la naissance de cervelets 5 souris). Placer le flacon papaïne dans un 5% de CO 2 37 ° C incubateur ou bain à 37 ° C pour l&#39;eau 5 à 10 minutes jusqu&#39;à ce que la papaïne est complètement dissous et la solution semble claire. Maintenir la solution à température ambiante pendant la dissection. </li><li> Ajouter 500 pi de EBSS d&#39;un flacon de DNase dans le Kit de dissociation. Mélanger délicatement en tapotant le flacon depuis DNase est sensible à la dénaturation de cisaillement. Ajouter 250 ul de cette solution dans le flacon contenant la papaïne (concentration finale est de 20 unités / ml et la papaïne 0,005% DNase). Enregistrer le flacon reste DNase pour une utilisation dans l&#39;étape 5.1 ou 6.1. </li></ol> Partie 3: Dissection et de suppression Méninges <ol><li> L&#39;âge optimal pour la culture cellulaire à partir de granules souris C57BL/6J est jour postnatal 4-6, lorsque le nombre de progéniteurs des cellules granulaires dans le EGL peaks1, 10. Disséquer les chiots un par un et que vous devenez plus familiers avec la dissection cérébelleuse essayer de réduire le temps de dissection à pas plus de 6 minutes par chiot. La vitesse est de l&#39;essence. Si l&#39;étape de gradient de Percoll est contourné, huit souriceaux postnatale jours-5 peut produire suffisamment de cellules pour une plaque de culture de 6 puits (ou six lamelles de 25 mm) ou de six plaques de culture à 4 puits (ou vingt-quatre 12 - lamelles mm). Rendement approximatif est de 4 à 5x106 cellules par des densités chiot et le placage peut varier entre 1 et 5.105 cellules/cm2. Comme les cellules de 15-20% sont perdus pendant la step4 Percoll, plus d&#39;animaux sont nécessaires pour obtenir la même densité cellulaire désirée. </li><li> Pipeter 15 ml de HBSS-glucose dans un plat de 60 mm de culture de tissus en plastique et 10 ml dans une solution stérile Falcon 15 ml tube en plastique conique. Mis sur la glace. </li><li> En dehors de la hotte, essuyez la tête du chiot avec de l&#39;éthanol à 70%. Utilisez des ciseaux Permaset à décapiter le chiot. (Décapitation ne sera pas montré dans la vidéo.) </li><li> Dans la hotte, maintenez la tête avec une pince Dumont de sorte que vous pouvez clairement voir l&#39;arrière du crâne. Accès au cerveau en insérant des ciseaux microdissecting dans le foramen magnum et coupe droite vers les yeux. En utilisant une pince, décoller la peau et soulevez le crâne afin d&#39;exposer le cerveau. En utilisant des pinces Dumont, pincez le cervelet et le mésencéphale environnante et le transférer dans le plat avec du HBSS-glucose. (Il est plus facile de manipuler le cervelet et de supprimer les méninges si le cervelet est encore attaché aux tissus environnants). </li><li> Sous la loupe binoculaire, retirez délicatement les méninges hors du cervelet et aussi entre les lobes avec un beau Dumont # 5 pince tout en utilisant la pince d&#39;autres pour ancrer le bas le cervelet à la plaque. Vous remarquerez les vaisseaux sanguins à la surface du cervelet. Ces vaisseaux sanguins sont un bon moyen d&#39;identifier les méninges. Retirez les méninges jusqu&#39;à ce que le cervelet prend un aspect mat blanc. Séparez le cervelet du reste du mésencéphale. Tournez à sa face ventrale et enlever la choroïde, plexus qui ressemble à un ruban rouge entre le cervelet et le mésencéphale ventral adjacentes. Placez chaque cervelet froide HBSS-glucose dans un tube de 15 ml conique sur la glace dès que disséqués. Les changements de la solution fraîche à dissection pour HBSS glucose après-dissection 3 des cerveaux. </li></ol> Partie 4: suspension cellulaire <ol><li> Une fois toutes les dissections sont terminées, retirez le HBSS-glucose dans le tube et le remplacer par la solution papaïne faite à l&#39;étape 2.4. Bien que le kit recommande couper le tissu en petits morceaux, nous constatons qu&#39;il n&#39;est pas nécessaire de couper ou de hacher les cervelets à cet âge. Placez la solution la papaïne tissus + (dans un tube conique de 15 ml) dans un bain d&#39;eau à 37 ° C ou 5% de CO 2 37 ° C incubateur pour 15 à 20 minutes. Pour 4 à 8 cervelets, à 15 minutes à 37 ° C est suffisante, car un grand nombre de cervelets 20 à 30 minutes est la meilleure. Agiter doucement le tube toutes les 3 à 4 minutes. </li><li> Triturer le mélange avec une solution stérile P1000 pointe de la pipette d&#39;aérosol qui a été enduit avec du FBS. Faites cette étape en douceur pour éviter toute formation de bulles d&#39;air. Pipettes en verre poli au feu peuvent être utilisées, mais nous constatons que le sérum stérile recouvert P1000 conseils aérosols fonctionnent tout aussi bien. Pour manteau de la pipette avec du FBS, FBS pipette haut et en bas deux fois juste avant utilisation. Environ 10 mouvements de haut en bas avec la pipette sont suffisantes pour dissocier les tissus. La solution devient trouble. Autoriser la suspension de s&#39;asseoir pendant 30-60 secondes pour que les gros morceaux de tissu non dissocié se déposent au fond du tube. </li><li> Retirer les cellules en suspension (attention à ne pas enlever les morceaux de tissu non dissocié à la bottom) dans un nouveau tube conique 15 ml avec un embout de pipette de sérum revêtement. Centrifuger à environ 200xg pendant 5 minutes à température ambiante. Préparer la remise en suspension à moyen terme. Pour ce faire, mélanger 2,7 ml EBSS avec 300 ul de solution d&#39;inhibiteur reconstitué albumine ovomucoïde dans un tube stérile. Ajouter 150 pi de solution de DNase partir de l&#39;étape 2.4. </li><li> Après centrifugation, éliminer le surnageant et immédiatement resuspendre le culot cellulaire dans la dilution de DNase / solution d&#39;inhibiteur d&#39;albumine préparée dans l&#39;étape 4.3 avec un sérum revêtement P1000 aérosols pointe de la pipette. </li><li> Préparer un gradient de densité discontinu comme suit. Ajouter 5 ml de solution d&#39;inhibiteur ovomucoïde albumine dans un tube de 15 ml conique. Soigneusement la couche de cellules en suspension sur le dessus. Centrifuger à environ 70xg pendant 6 minutes à température ambiante. Les cellules dissociées granulés au fond du tube, des fragments de membranes restent à l&#39;interface. </li><li> Si vous souhaitez obtenir des cultures qui sont enrichies en cellules granulaires, contourner l&#39;étape de séparation de gradient de Percoll (qui rendements des cultures pures de cellules granulaires du cervelet), et passez à la partie 6. Si vous souhaitez isoler davantage les cellules granulaires du gliales et des interneurones grande partie par la séparation gradient de Percoll, passez à la partie 5. Utilisation de l&#39;étape gradient de Percoll permettra de réduire le rendement des cellules. Dans nos mains, la réduction du rendement est d&#39;environ 20-35%. Cependant, il ya une augmentation dans l&#39;enrichissement des neurones granulaires et les cellules progénitrices d&#39;environ 90% à 95-99%. </li></ol> Partie 5: séparation par gradient de Percoll <ol><li> Jeter le surnageant et immédiatement Reprendre le culot dans 2 ml de HBSS-glucose avec 50 ul de DNase partir de l&#39;étape 2.4. Filtrer la suspension cellulaire si un filet de nylon (taille des pores 70 um) par gravité. Cette étape va supprimer de grandes cellules non-neuronales et prévoit une suspension cellulaire unique de mieux. </li><li> Préparer deux polie au feu en verre Pipettes Pasteur. Pour ce faire, doucement le bout de la flamme d&#39;une pipette de verre jusqu&#39;à la pointe est lissée et l&#39;alésage pipette est de 40-50% de la taille originale. Prenez soin de ne pas faire l&#39;ouverture trop petite. </li><li> Préparer gradient de Percoll. Placer 10 ml de solution de Percoll à 35% dans un tube de 50 ml conique stérile. 60% (10 ml) de Percoll est chargé dans une seringue de 10 ml stérile avec une aiguille stérile épinière attachée. Couche doucement la solution de Percoll à 60% en dessous de la solution 35%, en ajoutant la solution de 60% dans le bas du tube avec l&#39;aiguille spinale. Prenez soin de garder une interface nette entre les deux couches. Ajouter les cellules vers le haut de la pente à l&#39;aide d&#39;une pipette polie au feu, les délicatement en ajoutant le long du côté du tube sans déranger l&#39;interface. </li><li> Placez délicatement le tube dans la centrifugeuse et centrifuger à 1800xg. Montée en puissance de la vitesse d&#39;un pas toutes les 20 secondes (par incréments de vitesse sont les suivantes: environ 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) afin qu&#39;il dure environ 2 minutes pour atteindre la vitesse désirée. Démarrer le chronomètre à 10 min lorsque 1800xg est atteint. Lorsque vous avez terminé, diminuer graduellement la vitesse d&#39;un pas toutes les 20 secondes. </li><li> Enlever l&#39;interface supérieure de la pente (contenant glie grande, les cellules de Purkinje, et des interneurones) et le jeter. </li><li> Retirez délicatement les cellules à l&#39;interface entre les 35% et de Percoll à 60% avec une pipette polie au feu et transférer dans un tube conique de 50 ml. Remettre en suspension dans 3 volumes de HBSS-glucose et mélanger en retournant plusieurs fois. Centrifuger pendant 5 minutes à 1100xg. </li><li> Enlever le surnageant et ajouter 4 ml de milieu de FBS à 10% avec 50 ul de DNase. Reprendre le culot doucement à l&#39;aide d&#39;une pipette polie au feu pour former une suspension cellulaire unique. Passez à l&#39;étape 6.2. </li></ol> Partie 6: Pré-placage et placage <ol><li> Jeter le surnageant et immédiatement Reprendre le culot dans 4 ml de milieu de FBS à 10% avec 50 ul de DNase partir de l&#39;étape 2.4. Filtrer la suspension cellulaire si un filet de nylon (taille des pores 70 um) par gravité. Cette étape va supprimer de grandes cellules non-neuronales et prévoit une suspension cellulaire unique de mieux. </li><li> Plaque les cellules recueillies sur une poly-D-lysine revêtement pré-placage plat pendant 20 minutes dans un 5% de CO 2 37 ° C incubateur. Répétez l&#39;opération avec un plat frais. Les cellules astrocytes et plus lourdes vont se calmer et de respecter les plats et de laisser les neurones granulaires petites et les cellules progénitrices de neurones flottant. Après l&#39;incubation, les neurones granulaires vaguement adhéré et les cellules progénitrices de neurones sont facilement délogés et desserré avec les tapotant doucement de la plaque. </li><li> Recueillir les neurones granulaires et des cellules progénitrices de neurones dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 200xg pendant 5 minutes. Reprendre le culot dans 1 ml de milieu sans sérum et compter une aliquote de 10 pi en utilisant un hématimètre. </li><li> Ajouter un milieu sans sérum pour atteindre la densité cellulaire désirée. Directives Rough nombre de cellules à la plaque à densité moyenne: pour plaques de 6 puits, 3,5 à 4 millions de cellules; pour les plaques à 4 puits, 650 000 cellules. Pour plaques de 6 puits culture, je la plaque 1,5 ml / puits et des puits 4-plaTES, je plaque de 0,5 ml / puits. Les cellules sont maintenues dans un 5% de CO 2 37 ° C incubateur. Changer le support totalement 24 heures plus tard avec des modifications ultérieures tous les deux à trois jours. </li></ol>

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</ol>

Ce protocole est basé sur les modifications de procédures qui ont été décrites dans le 3,7,11 passé. Il ya plusieurs points importants à noter que discuté ci-dessous. Les neurones granulaires et les cellules progénitrices se conformer dans les 2 heures de placage. Les cellules saines ont une morphologie ronde sous le microscope de 4 à contraste de phase. Dans les 24 heures après l&#39;étalement, les cellules saines seront réparties uniformément autour du lamelles en plastique ou le bien et feront processus. Au ...

<table><tbody><tr><td>Filtre cellulaire avec pore de maille de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille rachidienne</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 pouces</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine, masse moléculaire&amp;gt;300 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Chaque nouveau lot de Poly-D-Lysine doit être testé.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Doit être sans calcium ni magnésium.</td></tr><tr><td>Milieu Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Supplément Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Supplément sans sérum B-27 (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips circulaires de 12 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Ces produits sont fabriqués en Allemagne par Deckglaser.</td></tr><tr><td>Coverslips circulaires de 25 mm</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Ces produits sont fabriqués en Allemagne par Deckglaser.</td></tr><tr><td>Système de dissociation à la papaine</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>Le kit permet cinq isolations.</td></tr><tr><td>Ciseaux Permaset</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont n°5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à 4 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de culture à 6 puits</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et culture de la post-natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices neuron et les neurones

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

Le cortex cérébelleux est une structure bien décrite qui fournit des occasions uniques pour l&#39;étude des propriétés des neurones et 1,2 de développement. Parmi les types de neurones du cervelet (cellules granulaires, les cellules de Purkinje et les interneurones inhibiteurs), les neurones granulaires sont de loin les plus nombreux et sont le type le plus abondant de neurones dans le cerveau des mammifères. Chez les rongeurs, les neurones granulaires du cervelet sont générés au cours des deux premières semaines post-natale à partir de cellules progénitrices dans la couche la plus superficielle du cortex cérébelleux, la couche granulaire externe (EGL). Le protocole présenté ici décrit les techniques d&#39;enrichir et de neurones granulaires de la culture et de leurs cellules progénitrices du cervelet de souris post-natale. Nous allons décrire les procédures pour obtenir des cultures de pureté croissante 3,4, ce qui peut être utilisé pour étudier la différenciation de la prolifération des cellules progénitrices dans les neurones granulaires 5,6. Une fois les cellules progénitrices se différencier, les cultures fournissent également une population homogène de neurones granulaires pour la manipulation expérimentale et la caractérisation des phénomènes tels que la synaptogenèse, la fonction des récepteurs du glutamate 7, interaction avec d&#39;autres cellules purifiées cérébelleuse 8,9 ou 7 la mort cellulaire.

Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.

Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

Le cortex cérébelleux est une structure bien décrite qui offre des opportunités uniques pour étudier les propriétés et le développement neuronaux1,2. Parmi les...

Cette procédure commence par la suppression du cervelet chez des souriceaux âgés de P quatre à P cinq. Les méninges et le plexus choroïde sont retirés des cervelets individuels, qui sont ensuite recueillis dans un tube conique de 15 millilitres. Les cervelets sont dissociés à l’aide de la papaine et mis en suspension monocellulaire par agitation douce.Cette suspension est filtrée par gravité à travers une maille en nylon ayant une taille de pore de 70 microns. Le filtrat est déposé délicatement en couche supérieure d'un gradient discontinu de Percoll et centrifugé afin de séparer les cellules granulaires de la glie en neurones et en neurones exprimant le gène Perkin. Les cellules situées à l'interface du gradient sont récupérées et pré-plaquées sur des plaques recouvertes de poly-l-lysine.Pour éliminer davantage les cellules gliales, les cellules granuleuses sont récupérées, comptées et mises en culture à des densités souhaitées sur des lamelles en verre ou des plaques de culture en plastique revêtues de poly-lysine. Bonjour, je suis Hey Young Lee du laboratoire du Dr Lloyd Green, du département d’anatomie pathologique de l’Université Columbia. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure permettant d’isoler et de cultiver des neurones cérébelleux granuleux provenant de souris postnatales.Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier la prolifération et la différenciation des progéniteurs neurogéniques des cellules granulaires. Commençons donc. Cette procédure commence par l'utilisation d'éthanol à 70 % dans la zone de dissection afin de dissocier les cellules granulaires cérébelleuses ; nous utilisons le système de dissociation Papain.Lorsque vous commencez un nouveau kit, préparez la solution d'inhibiteur d'albumine OVO équivalente MOID. Pour ce faire, prenez 32 millilitres de solution saline équilibrée d'Earle ou EBSS, fournie dans le kit, et ajoutez-la au mélange d'albumine OVO moid. Mettez-la de côté pendant la préparation des autres composants afin de permettre la dissolution des constituants.Ensuite, ajoutez cinq millilitres de EBSS à un flacon de papain provenant du kit de dissociation. Chaque flacon suffit pour dissocier de quatre à quinze cerveletts de souris P5. Placez ensuite le flacon de papain dans un incubateur à 5 % de CO2 et 37 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes, jusqu'à ce que le papain soit complètement dissous et que la solution apparaisse limpide.Conserver la solution à température ambiante pendant la dissection. Ensuite, ajouter 500 microlitres d'EBSS au flacon NAS 1D provenant du kit. Mélanger délicatement en tapotant le flacon.Étant donné que l'ADN est sensible à la dénaturation par cisaillement, ajouter 250 microlitres de cette solution au flacon de pepane afin d'obtenir une concentration finale de 20 unités par millilitre et de 0,005 % d'ADN ; conserver le reste de l'échantillon d'ADN pour une utilisation ultérieure. Une fois les outils et réactifs prêts, procéder à la dissection des cervelets et à l'élimination des méninges pour cette procédure. Des souris C57 noir six sont utilisées entre les jours postnataux quatre et six.Cet intervalle d'âge est optimal pour la culture des cellules granulaires, car le nombre de progéniteurs de cellules granulaires de la couche granulaire externe ou EGL est maximal. Commencez par pipeter 15 millilitres de HBSS glucose dans une boîte de culture plastique de 60 millimètres et 10 millilitres dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Placez le tube sur de la glace, essuyez la tête du petit avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux fins pour enlever la tête.Transférez la tête dans la hotte et maintenez-la avec une pince afin que l'arrière du crâne soit clairement visible. Insérez les ciseaux de dissection microscopiques dans le foramen magnum pour accéder au cerveau, puis coupez en ligne droite vers les yeux. Utilisez de fins ciseaux Dumont.Numéro cinq, utiliser une pince pour retirer la peau et soulever le crâne afin d'exposer le cerveau. Puis pincer le cervelet et le mésencéphale environnant. Transférer l'ensemble dans la boîte contenant du HBSS glucosé.Remarquez qu'il est plus facile de manipuler le cervelet et d'ôter les méninges si le cervelet est encore attaché aux tissus environnants. Ensuite, placez le tissu sous un microscope stéréoscopique. Puis utilisez une pince pour fixer le cervelet sur la plaque. Utilisez une pince fine Dumont n°5 pour détacher délicatement les méninges du cervelet ainsi que des sillons entre les lobes. Vous remarquerez la présence de vaisseaux sanguins à la surface du cervelet.Ces vaisseaux sanguins constituent un bon repère pour identifier les méninges. Poursuivez le retrait des méninges jusqu'à ce que le cervelet présente un aspect blanc feutré. Ensuite, séparez le cervelet du reste du mésencéphale.Placez-le sur son côté ventral et retirez le plexus choroïde, qui ressemble à un ruban rougeâtre situé entre le cervelet ventral et le mésencéphale adjacent. Dès que le cervelet est disséqué, placez-le dans du HBSS glucose froid dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace. Après la dissection de trois cerveaux, remplacez la solution de dissection par du HBSS glucose frais.Au fur et à mesure que vous vous familiariserez avec la dissection cérébelleuse, essayez de réduire le temps de dissection à pas plus de six minutes par animal. Une fois les dissections terminées, passez à la préparation de la suspension cellulaire. Étape pour générer une suspension cellulaire à partir des dissections cérébelleuses.Tout d'abord, retirez le HBSS glucose du tube et remplacez-le par la solution de papaine. Bien que le protocole recommande de découper le tissu en petits morceaux, nous constatons qu'il n'est pas nécessaire de le faire à cet âge. Incubez le tissu et la solution de papaine dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 15 à 20 minutes.Pour quatre à huit cervelets, incuber pendant 15 minutes. Pour un nombre plus élevé, incuber jusqu'à une demi-heure. Agiter doucement le tube toutes les trois à quatre minutes.Une fois l'incubation terminée, commencez l'étape de centrifugation : enduisez une pointe de pipette stérile P 1000 anti-aérosol de FBS en aspirant et expulsant deux fois. Déclenchez maintenant la centrifugation du mélange. Veillez à pipeter délicatement afin d'éviter la formation de bulles d'air.Environ 10 mouvements ascendants et descendants avec la pipette suffisent pour dissocier le tissu. La solution doit devenir trouble. Laisser la suspension reposer de 30 à 60 secondes afin que les éventuels morceaux de tissu non dissocié sédimentent au fond du tube.Bien que des pipettes en verre polies à la flamme puissent être utilisées pour la pipetage, nous constatons que des embouts stériles P 1000 recouverts de sérum fonctionnent tout aussi bien. Ensuite, transférez les cellules en suspension dans un nouveau tube conique de 15 ml à l’aide d’un embout de pipette recouvert de sérum, en prenant soin de ne pas prélever les fragments de tissu non associés situés au fond. Puis centrifugez la suspension cellulaire à environ 200 ×g pendant cinq minutes.À température ambiante pendant la centrifugation, préparez le milieu de suspension de ressus. Pour ce faire, ajoutez 2,7 millilitres de EBSS dans un tube stérile. Puis ajoutez 300 microlitres de la solution réconstituée d'albumine inhibitrice OVO MOID.Enfin, ajoutez 150 microlitres de la solution d'ADN. Une fois la centrifugation terminée, éliminez le surnageant et remettez immédiatement en suspension le culot cellulaire dans la solution diluée d'inhibiteur d'albumine d'ADN. Utilisez à nouveau une pointe de pipette revêtue de sérum pour remettre en suspension le culot.Préparez maintenant un gradient de densité discontinu. Pour ce faire, ajoutez cinq millilitres de la solution d'inhibiteur d'albumine oval MOID dans un tube conique de 15 millilitres. Superposez la suspension cellulaire sur la solution en ajoutant délicatement les cellules le long de la paroi du tube, puis centrifugez à environ 70 G pendant six minutes.À température ambiante, les cellules dissociées forment un culot au fond du tube tandis que les fragments membranaires restent à l'interface. Si vous souhaitez obtenir des cultures enrichies en cellules granulaires, aucune purification supplémentaire n'est nécessaire. Jetez le surnageant SUP et resuspendez immédiatement le culot dans quatre millilitres de milieu contenant 10 % de FBS avec 50 microlitres de DNAs.Filtrez cette suspension par gravité à l’aide d’une maille en nylon de 70 microns de taille de pore. Cette étape élimine les grandes cellules non neuronales et permet d’obtenir une meilleure suspension monocellulaire. Ensuite, contournez l’étape suivante de séparation par gradient par centrifugation et passez directement à l’étape de mise en culture des cellules.Ou, si vous souhaitez purifier davantage les cellules granuleuses en les séparant des cellules gliales et des grands interneurones, passez à l'étape du gradient Percoll. Étape : éliminez le surnageant et resuspendez immédiatement le culot dans deux millilitres de HBSS contenant du glucose, avec 50 microlitres d'ADNase.De nouveau, filtrer la suspension à travers un tamis en nylon. Avant de commencer la séparation sur gradient de Percoll, préparer deux pipettes Pasteur polies à la flamme. Chauffer doucement l'extrémité d'une pipette jusqu'à ce que le bord soit lisse et que le diamètre de l'orifice soit réduit d'environ moitié. Veiller à ne pas rendre l'ouverture trop petite.Préparez maintenant le gradient de Percoll. Placez 10 ml d'une solution de Percoll à 35 % dans un tube conique stérile de 50 ml. Ensuite, chargez 10 ml de Percoll à 60 % dans une seringue stérile de 10 ml munie d'une aiguille spinale stérile.Superposez délicatement la solution à 60 % sous la solution à 35 % en plaçant la pointe de la seringue au fond du tube. Veillez à maintenir une interface nette entre les deux couches. Ensuite, ajoutez les cellules au sommet du gradient.À l’aide d’une pipette polie à la flamme, ajoutez délicatement les cellules le long du côté du tube sans perturber l’interface. Après avoir soigneusement superposé les cellules, placez le tube dans la centrifugeuse. Commencez la centrifugation à environ 18 G. Augmentez progressivement la vitesse d’un palier toutes les 20 secondes, de sorte qu’il faille environ deux minutes pour atteindre 1800 G. Après 10 minutes à 1800 G, réduisez graduellement la vitesse d’un palier toutes les 20 secondes.Lorsque la centrifugation est terminée, retirez la phase supérieure de l'interface du gradient et jetez-la. Cette interface contient de grandes cellules ggl bikini et des interneurones. Ensuite, utilisez une pipette à embout poli au feu pour prélever soigneusement les cellules situées à l'interface.Transférez les cellules dans un tube de 50 ml. Si le volume s'avère supérieur à 15 ml, répartissez-les dans deux tubes de 50 ml et resuspendez-les dans trois volumes de glucose HB S'S, puis mélangez en retournant plusieurs fois. Centrifugez ensuite pendant cinq minutes à 1100 ×g. Éliminez maintenant le surnageant et ajoutez 4 ml de milieu contenant 10 % de FBS et 50 microlitres de D ns reus.Resuspendre délicatement le culot à l’aide d’une pipette polie à la flamme pour obtenir une suspension monocellulaire. Une fois les cellules resuspendues, procéder à la préplaque. Les cellules préplaque les cellules recueillies sur une boîte revêtue de polylysine pendant 20 minutes.Dans une incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. Pendant l'incubation, les astroglies et les cellules plus lourdes vont se déposer et adhérer aux boîtes, tandis que les petits neurones granulaires et les cellules progénitrices neuronales resteront en suspension ou faiblement attachées. Après 20 minutes, tapotez doucement sur la boîte pour détacher les cellules granulaires faiblement adhérentes.Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans une nouvelle plaque revêtue de poly-d-lysine et répétez l'incubation. Puis, récupérez les neurones granulaires et les cellules progénitrices neuronales dans un tube conique de 15 ml et centrifugez à 200 ×g pendant cinq minutes. Resuspendez ensuite le culot dans 1 ml de milieu sans C et effectuez un dénombrement à l’aide d’un hémocytomètre.Enfin, ajoutez du milieu sans sérum pour atteindre la densité cellulaire souhaitée afin de semer à une densité moyenne. Pour les plaques à six puits, utilisez environ trois millions et demi à quatre millions de cellules pour les plaques à quatre puits.Utilisez 650 000 cellules. Maintenez les cellules dans un incubateur à 37 degrés avec 5 % de CO2. Changez complètement le milieu 24 heures après le semis initial, puis tous les deux à trois jours par la suite.Voici quelques images de cultures saines de neurones granulaires et de cellules progénitrices. 24 heures après le semis et six jours après le semis. Ces cellules peuvent être maintenues en culture jusqu'à deux semaines.Remarquez que dans les 24 heures suivant la mise en culture, les cellules saines s'étalent uniformément autour des lamelles ou de la cavité en plastique et émettent des prolongements. L'agrégation des cellules et la présence de varicosités sur les prolongements cellulaires indiquent que les cellules sont en mauvaise santé ou que le substrat de polylysine est toxique. Comme le montre le schéma, les progéniteurs de neurones granulaires commencent à se différencier dès la mise en culture et expriment des marqueurs.Représentatif de leur différenciation. La prolifération des progéniteurs de neurones granulaires peut être considérablement prolongée par l'ajout de hedgehog sonique dans le milieu. De la laminine peut également être ajoutée comme substrat en complément de la polylysine afin de favoriser l'élaboration des neurites.Ces caractéristiques de la culture de cellules granulaires offrent un système permettant d'étudier soit la biologie des neurones granulaires, soit la régulation de la différenciation des cellules progénitrices en neurones. Nous venons de vous montrer comment isoler et cultiver des progéniteurs neuronaux et des neurones granulaires cérébelleux MAO. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que le rendement approximatif est de 4 à 5 × 10⁶.Pour chaque pupille, le nombre de cellules est de six et les densités de mise en culture peuvent varier entre cinq fois le nombre de cellules au centre par centimètre carré. Ainsi, si l'étape du gradient de périko est contournée, huit souriceaux de cinq jours postnataux peuvent fournir suffisamment de cellules pour six plaques de culture à quatre puits ; selon mon expérience, l'utilisation de l'étape du gradient de périko réduira le rendement cellulaire d'environ 2230 5 %. Toutefois, le pourcentage de neurones granulaires dans les cultures augmente de 90 à 95 % jusqu'à 99 %. Les cellules granulaires enrichies obtenues sans l'étape de séparation par gradient de périko ont été utilisées pour étudier la régulation de la prolifération et de la différenciation des progéniteurs de neurones granulaires. Cependant, si les cultures doivent être utilisées au-delà de plusieurs jours in vitro, l'inclusion de l'étape du gradient de périko est recommandée afin de réduire la contamination des neurones granulaires par des cellules non neuronales proliférantes.En outre, assurez-vous que les solutions utilisées pour préparer le gradient par coté sont fraîches, car un mauvais tamponnage entraîne une mort cellulaire accrue. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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