Name: winogradsky column microbial layers and gradients
Uploaded: 2023-04-30T07:09:27.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

1. הגדרת
<ol><li>כדי להגדיר עמודת Winogradsky, תזדקק לכמה חומרים מתכלים בסיסיים:<ul>
<li>את חפירה, דלי ובקבוק לאיסוף הדגימות בשטח</li>
		<li>כלי אנכי ושקוף, כגון גליל מדורג או בקבוק מים מפלסטיק של כ-1 ליטר</li>
		<li>ניילון נצמד וגומיות</li>
		<li>קערות ערבוב גדולות וכף גדולה לערבוב</li>
		<li>מקור גופרית (חלמון ביצה או סידן גופרתי)</li>
		<li>מקור של פחמן אורגני (תאית, בצורה של עיתון מגורר)</li>
		<li>מקור אור (חלון שטוף שמש או מנורת שולחן)</li>
		<li>אדמה או בוץ שנאספו מביצה, ביצות, בריכה או נחל</li>
		<li>מים מאותו בית גידול</li>
		<li>OPTIONAL, יהיה צורך בניסויים האופציונליים המתוארים בפרוטוקול זה:<ul>
<li>מלח שולחן</li>
			<li>צלופן בצבע שונה</li>
			<li>מקור ברזל (כגון מסמר או צמר פלדה)</li>
			<li>מקרר עם מקור אור</li>
			<li>רדיאטור ליד מקור אור</li>
		</ul>
</li>
	</ul>
</li>
	<li>אם משתמשים בבקבוק מים מפלסטיק, חותכים את אזור הצוואר כך שהעמודה מעוצבת באופן גלילי. הסר את כל העטיפות כך שהאור יוכל לחדור דרך הפלסטיק.</li>
	<li>ביצים לא מבושלות עשויות להכיל סלמונלה ויש לטפל בהן בזהירות. יש לעקוב אחר טכניקות שטיפת ידיים מתאימות. לחלופין, ביצה מבושלת ניתן להשתמש. בנוסף, אין דרך לדעת בוודאות אם בוץ או משקעים מזוהמים עם ביוב או חומר מזיק אחר. כפפות יש להשתמש בעת ערבוב הבוץ והקמת העמוד.</li>
</ol>2. הרכבת טור וינוגרדסקי
<ol><li>בעזרת האת, לחפור ולאסוף בוץ לתוך הדלי. משקעים צריכים להיות ליד שפת המים ורוויים לחלוטין במים. תזדקק למספיק בוץ כדי למלא כל טור של וינוגרדסקי. לאסוף קצת מים מאותו מקור לתוך בקבוק המדגם (כ 3000 מ"ל לכל עמודה יש צורך).</li>
	<li>במעבדה, העבירו מספיק בוץ לקערת הערבוב הראשונה כדי למלא כ-75% מעמודת הנפח של ליטר אחד. לאחר מכן, לנפות כדי להסיר סלעים גדולים, זרדים, או עלים תוך שימוש בכף לשבור גושים.</li>
	<li>מוסיפים חלק מהמים שאספת לקערת הערבוב תוך כדי ערבוב. מוסיפים עד שהעקביות של תערובת בוץ המים היא כמו מילקשייק. המשך לוודא שאין גושים.</li>
	<li>מעבירים כ-1/3 ממילקשייק בוץ המים לקערה השנייה. מוסיפים את החלמון וקומץ עיתון מגורר ומערבבים.</li>
	<li>מוסיפים לטור את תערובת הבוץ, החלמון והעיתון עד שהטור מלא ב-1/4.</li>
	<li>מוסיפים את תערובת בוץ המים הרגילה לעמודה עד שהעמודה מלאה ב-3/4.</li>
	<li>מוסיפים את המים הנוספים לעמודה, ומשאירים רק חלל קטן (~1/2 אינץ') של אוויר למעלה.</li>
	<li>מכסים את העמוד בניילון נצמד ומאובטחים בגומייה.</li>
	<li>לדגור על העמוד באור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>במשך 4 עד 8 השבועות הבאים, נטר שינויים בעמודה וינוגרדסקי לפיתוח שכבות צבעוניות שונות ויצירת בועות, כמתואר בטבלה 1. בנוסף, עליך לתעד את הזמן שלוקח לפתח שכבות שונות.</li>
</ol>3. שינויים אופציונליים בעמודה הקלאסית של וינוגרדסקי
<ol><li>מוסיפים 25-50 גרם מלח לעמוד וינוגרדסקי 1L לבוץ שנאסף לפני הוספת מים וערבוב (שלב 2.3). תוספת המלח בוחרת לחיידקים הלופיליים (אוהבי מלח).</li>
	<li>מצעים חלופיים, כגון ברזל, בצורה של מסמר או צמר פלדה, ניתן להוסיף לעמוד יחד עם חלמון הביצה ואת העיתון מגורר (שלב 2.4). זה יעשיר חיידקים מחמצנים ברזל, כגון Gallionella, ויופיע כמו שכבה בצבע חלודה.</li>
	<li>במקום טמפרטורת החדר (שלב 2.9), ניתן לדגור על הטור ליד רדיאטור כדי לבחור חיידקים תרמופיליים (אוהבי חום) או במקרר עם מקור אור לבחירה עבור חיידקים פסירופיליים (אוהבי קור).</li>
	<li>כמות האור שעמודה מקבלת כשהיא מדגירה (שלב 2.9) יכולה להיות מגוונת גם על-ידי הצבת עמודות שונות באור גבוה, באור נמוך או בחושך.</li>
	<li>אורך הגל של האור הנכנס יכול להיות מוגבל על ידי כיסוי העמוד עם צלופנים מוצלים שונים כפי שהוא מדגירה (שלב 2.9) כדי לקבוע אילו צבעים לבחור עבור קבוצות חיידקים שונות.</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>לאחר 1-3 שבועות, כמה צביעה ירוקה על גבי שכבת הבוץ של טור וינוגרדסקי הקלאסי צריך להיות גלוי (איור 2A). אלה הם הסימנים הראשונים לצמיחה של השכבה הציאנובקטריאלית.</li>
	<li>עם הזמן, המשיכו לעקוב אחר המראה והאבולוציה של השכבות השונות, שכל אחת מהן מעידה על סוגי החיידקים השונים. רמז: עיין במושגים ובטבלה 1 כדי להבין אילו חיידקים תורמים לשכבות השונות.</li>
</ol><img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2a.jpg"> איור 2א: תמונה של טור וינוגרדסקי קלאסי שדגר בטמפרטורת החדר במשך 21 יום. שים לב למ משקעים ירוקים, המעידים על ציאנובקטריה, בחלק העליון של העמודה.
<ol start="3"><li>אם הוכנו גם שינויים בעמודה הקלאסית של וינוגרדסקי, השווה את התוצאות של כל עמודה.<ol>
<li>שים לב לשכבות בכל אחת מהעמודות של ווינגרדסקי שהשתנו. שים לב לאפשרויות הבאות:<ul>
<li>האם העמודות מציגות את אותו מספר שכבות?</li>
			<li>האם השכבות הן באותו צבע ועובי?</li>
			<li>האם השכבות מתרחשות באותם עומקים?</li>
			<li>כמה זמן לקח לפתח כל עמודה?</li>
			<li>האם עמודה אחת התפתחה לאט יותר מהאחרים?</li>
		</ul>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

הטור של וינוגרדסקי הוא דוגמה למערכת אקולוגית מיקרוביאלית תלויה זו בזו. לאחר ערבוב בוץ, מים, ומצעים נוספים של פחמן וגופרית בעמוד אנכי, המערכת האקולוגית המרובדת צריכה להתייצב לאזורים נפרדים ויציבים במשך מספר שבועות. אזורים אלה תפוסים על ידי מיקרואורגניזמים שונים אשר פורחים בנקודה מסוימת לאורך השיפוע בין המשק העשיר בסולפיד בתחתית לבין משקעים עשירים בחמצן בחלק העליון. על ידי מניפולציה של התנאים והמצעים בתוך הטור וינוגרדסקי, נוכחות ופעילות של מיקרואורגניזמים שונים כגון הלופילים, תרמופילים, psychrophiles, מחמצני גופרית, מפחית ...

יצירת טור וינוגרדסקי: שיטה להעשרת המינים המיקרוביאליים בדוגמת משקעים

Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

מקור: אליזבת סוטר1, כריסטופר קורבו1, ג'ונתן בלייז1 1 המחלקה למדעי הביולוגיה, מכללת וגנר, דרך הקמפוס 1, סטטן איילנד ניו יורק, 10301
הטור וינוגרדסקי הוא מערכת אקולוגית זעירה וסגורה המשמשת להעשרת קהילות מיקרוביות משקעים, במיוחד אלה המעורבות ברכיבה על אופניים גופרית. הטור שימש לראשונה את סרגיי וינוגרדסקי בשנות ה-80 של ה-19 ומאז הוא מיושם במחקר של מיקרואורגניזמים רבים ומגוונים המעורבים בביוגוכימיה, כגון פוטוסינתזה, מחמצני גופרית, מפחית גופרתיים, מתנוגנים, מחמצני ברזל, רוכבי חנקן ועוד (1,2).
רוב המיקרואורגניזמים על פני כדור הארץ נחשבים בלתי ניתנים לחישוב, כלומר הם לא יכולים להיות מבודדים במבחנה או על צלחת פטרי (3). הסיבה לכך היא גורמים רבים, כולל כי מיקרואורגניזמים תלויים אחרים עבור מוצרים מטבוליים מסוימים. התנאים בטור של וינוגרדסקי מחקים מקרוב את בית הגידול הטבעי של מיקרואורגניזם, כולל האינטראקציות שלהם עם אורגניזמים אחרים, ומאפשרים לגדל אותם במעבדה. לפיכך, טכניקה זו מאפשרת למדענים לחקור אורגניזמים אלה ולהבין כיצד הם חשובים למחזורים הביו-גיאוכימיים של כדור הארץ מבלי לגדל אותם בבידוד.
סביבות כדור הארץ מלאות במיקרואורגניזמים המשגשגים בכל סוגי בתי הגידול, כגון קרקעות, מי אוקיינוס, עננים ומשקעים במעמקי הים. בכל בתי הגידול, מיקרואורגניזמים תלויים זה בזה. ככל שהמיקרואורגניזם גדל, הוא צורך מצעים מסוימים, כולל דלקים עשירים בפחמן כמו סוכרים, כמו גם חומרים מזינים, ויטמינים וגזים נשימתיים כמו חמצן. כאשר משאבים חשובים אלה נגמרים, מיקרואורגניזמים שונים עם צרכים מטבוליים שונים יכולים לפרוח ולשגשג. לדוגמה, בעמודה וינוגרדסקי, חיידקים צורכים תחילה את החומר האורגני שנוסף תוך כדי פירוק החמצן בשכבות התחתונות של העמודה. ברגע שהחמצן מנוצל, אורגניזמים אנאירוביים יכולים להשתלט ולצרוך חומרים אורגניים שונים. התפתחות רצופה זו של קהילות מיקרוביות שונות לאורך זמן נקראת ירושה (4). ירושת מיקרוביאלית חשובה בטור וינוגרדסקי, שבו פעילות מיקרוביאלית משנה את הכימיה של המשקעים, אשר לאחר מכן משפיע על פעילות של חיידקים אחרים וכן הלאה. מיקרואורגניזמים רבים בקרקעות ובמ משקעים חיים גם לאורך שיפועים, שהם אזורי מעבר בין שני סוגים שונים של בתי גידול המבוססים על ריכוזי המצעים (5). בנקודה הנכונה במעבר הצבע, חיידק יכול לקבל כמויות אופטימליות של מצעים שונים. עם התפתחות טור וינוגרדסקי, הוא מתחיל לחקות את השיפועים הטבעיים הללו, במיוחד בחמצן וגופרית (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig1.jpg"> איור 1: ייצוג של שיפועי חמצן (O2) וגופרית (H2S) המתפתחים בעמודה של וינוגרדסקי.
בעמוד וינוגרדסקי, בוץ ומים מבריכה או ביצות מעורבבים בעמוד שקוף ומותר להם לדגור, בדרך כלל באור. מצעים נוספים מתווספים לעמודה כדי לתת למקורות הקהילה של פחמן, בדרך כלל בצורה של תאית, וגופרית. פוטוסינתזות בדרך כלל מתחילות לגדול בשכבות העליונות של המשתך. מיקרואורגניזמים פוטוסינתזה אלה מורכבים ברובם ציאנובקטריה, המייצרים חמצן ומופיע כשכבה ירוקה או אדומה-חומה (איור 2, טבלה 1). בעוד הפוטוסינתזה מייצרת חמצן, חמצן אינו מסיס מאוד במים והוא יורד מתחת לשכבה זו (איור 1). זה יוצר שיפוע של חמצן, החל בריכוזים גבוהים של חמצן בשכבות העליונות לאפס חמצן בשכבות התחתונות. השכבה המחומצנת נקראת השכבה האירובית והשכבה ללא חמצן נקראת השכבה ה אנאירובית.
בשכבה אנאירובית, קהילות מיקרוביות רבות ושונות יכולות להתרבות בהתאם לסוג וכמות המצעים הזמינים, למקור החיידקים הראשוניים ולנקבוביות המשקעים. בתחתית העמוד, אורגניזמים שמפרקים חומר אורגני באופן אנאירובי יכולים לשגשג. תסיסה מיקרוביאלית מייצרת חומצות אורגניות מפירוק תאית. חומצות אורגניות אלה יכולות לשמש לאחר מכן על ידי מפחית סולפט, אשר מחמצנים את אותם אורגנים באמצעות סולפט, ומייצרים גופרתיתו כיוצר לוואי. הפעילות של מפחית גופרתיים מסומנת אם המשתך הופך שחור, כי ברזל וגופרית מגיבים ליצירת מינרלים שחורים מברזל גופרתי (איור 2, טבלה 1). הגופרית גם מתפזרת כלפי מעלה ויוצרת שיפוע נוסף שבו ריכוזי הגופרית גבוהים בתחתית העמוד ונמוכים בחלק העליון של העמודה (איור 1).
בסמוך לאמצע העמוד, מחמצני גופרית מנצלים את אספקת החמצן מלמעלה וגופרית מלמטה. עם הכמות הנכונה של אור, חמצון גופרית פוטוסינתזה יכול להתפתח בשכבות אלה. אורגניזמים אלה ידועים כחיידק גופרית ירוק וסגול , ולעתים קרובות מופיעים כחיתים וכתמים ירוקים, סגולים או סגולים-אדומים (איור 2, טבלה 1). חיידקי גופרית ירוקה יש סובלנות גבוהה יותר עבור גופרית ובדרך כלל לפתח בשכבה ישירות מתחת חיידקי גופרית סגולה. מעל חיידקי הגופרית הסגולה, חיידקים סגולים שאינם גופרית עשויים להתפתח גם. אורגניזמים אלה פוטוסינתזה באמצעות חומצות אורגניות כתורמים אלקטרונים במקום גופרתי ולעתים קרובות מופיעים כמו שכבה אדומה, סגולה, כתומה או חומה. מחמצני גופרית לא-פוטוסינתטיים יכולים להתפתח מעל החיידקים הסגולים שאינם גופרית, ואלה מופיעים בדרך כלל כחיתים לבנים (איור 2, טבלה 1). בנוסף, בועות עשויות להיווצר גם בעמודה וינוגרדסקי. בועות בשכבות האירוביות מצביעות על ייצור חמצן על ידי הציאנובקטריה. בועות בשכבות אנאירוביות נובעות ככל הנראה מפעילות של מתנוגנים, אורגניזמים אשר באופן אנאירובי לשבור חומר אורגני וליצור מתאן כמו תוצר לוואי.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מיקום בעמודה</td>
			<td>קבוצה פונקציונלית</td>
			<td>דוגמאות לאורגניזם</td>
			<td>מחוון חזותי</td>
		</tr>
<tr>
<td>סביבון</td>
			<td>פוטוסינתזות</td>
			<td>ציאנובקטריה</td>
			<td>שכבה ירוקה או חומה אדמדמה. לפעמים בועות של חמצן.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5"></td>
			<td>מחמצני גופרית לא-פוטוסינתטיים</td>
			<td>בג'יאטואה, תיובסילוס</td>
			<td>שכבה לבנה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>חיידקים סגולים שאינם גופרית</td>
			<td>רודומיכרוביום, רודוספירילום, רודופסאודמונאס</td>
			<td>שכבה אדומה, סגולה, כתומה או חומה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>חיידקי גופרית סגולה</td>
			<td>כרומטיום</td>
			<td>שכבה סגולה, או סגולה-אדומה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>חיידקי גופרית ירוקה</td>
			<td>כלורוביום</td>
			<td>שכבה ירוקה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>חיידקים להפחתת גופרתית</td>
			<td>Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas</td>
			<td>שכבה שחורה.</td>
		</tr>
<tr>
<td>ישבן</td>
			<td>מתנוגנים</td>
			<td>מתנוקוקוס, מתנוזרצ'ינה</td>
			<td>לפעמים בועות של מתאן.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הקבוצות העיקריות של חיידקים שעשויים להופיע בעמודה וינוגרדסקי קלאסית, מלמעלה למטה. דוגמאות של אורגניזמים מכל קבוצה ניתנות, ואת האינדיקטורים החזותיים של כל שכבה של אורגניזמים מפורטים. מבוסס על פרי ואח ' (2002) ורוגן ואח ' (2005).

בניסוי זה נאספו מים ומשקעים מבית גידול של מים מתוקים. שני עמודי וינוגרדסקי נבנו והותר להם להתפתח: טור וינוגרדסקי קלאסי דגירה באור בטמפרטורת החדר (איור 2א) וטור וינוגרדסקי דגירה בחושך בטמפרטורת החדר (איור 2B).
<img alt="Figure 2B" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2b.jpg"> איור 2ב: תמונה של טור וינוגרדסקי קלאסי (משמאל), דגירה בטמפרטורת החדר באור במשך 68 ימים ועמוד וינוגרדסקי דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 68 ימים (מימין).
לאחר ...

Source: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 
...

רוב המיקרואורגניזמים של כדור הארץ אינם ניתנים לתרבית במעבדה, לעתים קרובות מכיוון שהם מסתמכים על מיקרובים אחרים בתוך הקהילות הילידיות שלהם. עמוד וינוגרדסקי, שנקרא על שם ממציאו סרגיי וינוגרדסקי, הוא מערכת אקולוגית מיניאטורית וסגורה המעשירה את קהילות החיידקים בתוך דגימת משקעים, ומאפשרת למדענים לחקור רבים מהחיידקים הממלאים תפקיד חיוני בתהליכים הביו-גיאוכימיים של כדור הארץ, ללא צורך לבודד ולתרבית אותם בנפרד. בדרך כלל, בוץ ומים ממערכת אקולוגית, כגון בריכה או ביצה, מעורבבים. כניסוי אופציונלי, ניתן להוסיף מלח לתערובת זו כדי להעשיר מיני הלופילים שונים. לאחר מכן, חלק קטן מהתערובת מתווסף בפחמן, בדרך כלל בצורת תאית מעיתון, וגופרית, בדרך כלל מחלמון ביצה. לניסוי אופציונלי נוסף, ניתן להוסיף מסמר לתערובת זו כדי להעשיר מינים מסוימים של גליונלה. לאחר מכן מוסיפים את התערובת החדשה הזו לעמודה שקופה, כך שהעמודה תהיה רבע מלאה. לבסוף, שאר תערובת הבוץ ועוד מים מוסיפים לעמוד עד שהוא מלא רוב הדרך. רצף, המתייחס להתפתחות רציפה של קהילות מיקרוביאליות שונות לאורך זמן, ניתן לצפות בזמן אמת באמצעות עמודת וינוגרדסקי. כאשר מיקרובים גדלים בתוך העמודה, הם צורכים מצעים ספציפיים ומשנים את הכימיה של סביבתם. כאשר המצעים שלהם מתרוקנים, המיקרובים המקוריים מתים וחיידקים עם צרכים מטבוליים שונים יכולים לשגשג בסביבה שהשתנתה. עם הזמן מתחילות להיווצר שכבות נפרדות לעין, שכל אחת מהן מכילה חלקים של קהילת חיידקים עם צרכים מיקרו-סביבתיים שונים. לדוגמה, מיקרובים פוטוסינתטיים, המורכבים בעיקר מציאנובקטריה, יוצרים שכבות ירוקות או אדומות-חומות ליד החלק העליון של העמודה. מכיוון שפוטוסינתזה מייצרת חמצן, הנראה לעתים קרובות כבועות בחלק העליון של העמודה, נוצר שיפוע עם ריכוזי החמצן הגבוהים ביותר ליד החלק העליון, והנמוך ביותר לכיוון התחתון. בהתאם למצעים הזמינים, קהילות מיקרוביאליות שונות יכולות לצמוח בשכבה התחתונה האנאירובית. בועות בשכבה זו יכולות להצביע על נוכחות של מתאנוגנים, היוצרים גז מתאן באמצעות תסיסה. כאן, התסיסה המיקרוביאלית של תאית מביאה לחומצות אורגניות. מפחיתי סולפט מחמצנים את החומצות הללו כדי לייצר סולפיד, ופעילותם מסומנת על ידי משקעים שחורים. סולפיד מתפזר כלפי מעלה בעמודה, ויוצר שיפוע נוסף שבו ריכוזי הסולפיד הם הגבוהים ביותר לכיוון תחתית העמודה, והנמוכים ביותר ליד החלק העליון. לקראת אמצע העמוד, מחמצני גופרית מנצלים את החמצן מלמעלה ואת הסולפיד מלמטה. עם אור נאות, מתפתחים מחמצני גופרית פוטוסינתטיים, כגון חיידקי גופרית ירוקים וסגולים. חיידקי גופרית ירוקים סובלים ריכוזי סולפידים גבוהים יותר. לפיכך, הם גדלים ישירות מתחת לחיידקי הגופרית הסגולה. ישירות מעל שכבה זו, חיידקים סגולים שאינם גופרית יוצרים שכבה אדומה-כתומה. מחמצני גופרית שאינם פוטוסינתטיים מסומנים על ידי נוכחות של חוטים לבנים. תנאים כמו אור וטמפרטורה יכולים להיות מגוונים גם כדי להעשיר קהילות אחרות. בסרטון זה תלמדו כיצד לבנות עמוד וינוגרדסקי, ולגוון את תנאי הגידול והמצעים כדי להעשיר קהילות מיקרוביאליות ספציפיות. ראשית, אתר מערכת אקולוגית מימית מתאימה, כגון בריכה או ביצה. דגימות המשקעים צריכות להגיע מהאזור הסמוך לשפת המים, ולהיות רוויות לחלוטין במים. לאחר מכן, השתמש באת ובדלי כדי לאסוף ליטר עד שניים מהבוץ הרווי. לאחר מכן, השיגו כשלושה ליטרים של מים מתוקים מאותו מקור וחזרו למעבדה עם דגימות השדה. במעבדה יש ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים, כולל חלוק מעבדה וכפפות. כעת, העבירו כ-750 מיליליטר בוץ לקערת ערבוב. לאחר מכן, מנפים את הבוץ כדי להסיר סלעים גדולים, זרדים או עלים והשתמשו בכף כדי לפרק גושים. לאחר מכן, מוסיפים מעט מהמים המתוקים לקערת הערבוב, ומערבבים בעזרת כף גדולה. מוסיפים מים עד שעקביות תערובת המים-בוץ דומה למילקשייק. המשך לוודא שאין גושים. כניסוי אופציונלי, בחר עבור חיידקים הלופיליים על ידי הוספת 25 עד 50 מיליגרם מלח לתערובת הבוץ. לאחר מכן, העבירו כ-1/3 מתערובת המים-בוץ לקערת ערבוב שנייה. מוסיפים לקערה חלמון אחד וחופן עיתון מגורר. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת הזו לעמודה, עד שהיא מלאה בערך 1/4. לאחר מכן, מוסיפים לעמודה את תערובת המים-בוץ ללא הביצה והעיתון, עד שהיא מלאה בערך 3/4. לאחר מכן, הוסף עוד מים לעמוד, והשאיר מרווח של 1/2 אינץ 'למעלה. מכסים את העמוד בניילון נצמד ומהדקים אותו בגומייה. דגרו את העמוד באור ליד חלון בטמפרטורת החדר במשך ארבעת עד שמונה השבועות הבאים. לאורך כל תקופת הדגירה, עקוב אחר שינויים בעמודת וינוגרדסקי לפחות פעם בשבוע להתפתחות שכבות צבעוניות שונות והיווצרות בועות. בנוסף, רשום את הזמן שלוקח לשכבות שונות להתפתח. שינוי נוסף שניתן לעשות הוא דגירה של העמוד ליד רדיאטור כדי לבחור חיידקים תרמופיליים, או במקרר כדי לבחור חיידקים פסיכופיליים. שנה את תנאי האור על ידי הצבת עמודים שונים באור גבוה, אור חלש או חושך לדגירה. לחלופין, הגבל את אורך הגל של האור הנכנס על ידי כיסוי העמודה בגוונים שונים של צלופן כדי לקבוע אילו צבעים בוחרים עבור קבוצות חיידקים שונות. לניסוי אופציונלי נוסף, כדי להעשיר חיידקים מחמצני ברזל, הוסיפו מסמר לתערובת מי הבוץ לפני הוספת עיתון וחלמון ביצה. לאחר שבוע עד שבועיים, צמיחת השכבה הציאנובקטריאלית מסומנת על ידי סרט ירוק או אדום-חום על גבי שכבת הבוץ של עמוד וינוגרדסקי הקלאסי. עם הזמן עוקבים אחר המראה וההתפתחות של השכבות השונות, כל אחת מעידה על סוגי החיידקים השונים הקיימים. כאשר משווים עמוד שגדל בחושך לעמוד וינוגרדסקי מסורתי, אנו רואים שהטיפול הכהה מניב את השכבה השחורה בתחתית העמודה, המעידה על חיידקים מפחיתי סולפט. העמודה הכהה עשויה להניב גם שכבות אחרות, בהתאם לתנאי דגירה אחרים. בנוסף, העמודה הכהה אינה מניבה את השכבה הציאנובקטריאלית הירוקה, וגם לא את השכבות האדומות, הסגולות או הירוקות המעידות על חיידקי גופרית סגולים שאינם גופרית, גופרית סגולה וחיידקי גופרית ירוקה בהתאמה. קבוצות אלה תלויות באור לצמיחה.

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Microbiology

מיקרוביולוגיה

winogradsky column microbial layers and gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles.

The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon, usually cellulose, and sulfur are added, and the column is incubated in light. As microbes use these resources, they go through succession, which means one community replaces another as conditions change. This activity also creates gradients, or zones with changing chemical levels, especially for oxygen and sulfide.

At the top of the column, photosynthesizers grow first. These are mostly cyanobacteria, which make oxygen and often appear as a green or reddish-brown layer. Because oxygen is not very soluble in water, its concentration drops quickly below this zone. That creates an aerobic layer with oxygen at the top and an anaerobic layer with no oxygen below.

Deeper in the column, microbes that do not need oxygen can become active. At the bottom, organisms break down organic matter without oxygen, and fermentation of cellulose produces organic acids. Sulfate reducers then use these organics with sulfate and release sulfide. When iron reacts with sulfide, the sediment turns black and forms iron-sulfide minerals.

Sulfide also moves upward, so the middle of the column becomes a place where oxygen from above and sulfide from below meet. With enough light, sulfur-using photosynthesizers grow here. Green sulfur bacteria and purple sulfur bacteria often form green, purple, or purple-red layers. Green sulfur bacteria usually sit below purple sulfur bacteria because they tolerate more sulfide.

Above the purple sulfur bacteria, purple nonsulfur bacteria may form red, purple, orange, or brown layers. These microbes use organic acids as electron donors instead of sulfide. Higher up, nonphotosynthetic sulfur oxidizers can appear as white filaments. Bubbles may also form in the column. Oxygen bubbles in the aerobic layers come from cyanobacteria, while methane bubbles in the anaerobic layers are likely made by methanogens.

A mature Winogradsky column can show several microbial groups from top to bottom. Cyanobacteria are at the top, followed by nonphotosynthetic sulfur oxidizers, purple nonsulfur bacteria, purple sulfur bacteria, green sulfur bacteria, sulfate-reducing bacteria, and methanogens near the bottom. The visible colors, filaments, black sediment, and bubbles make the column a useful model for studying how microbes depend on one another in layered environments.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

winogradsky-column-microbial-layers-and-gradients

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Explore how a Winogradsky column forms microbial layers, oxygen and sulfide gradients, and visible signs of cyanobacteria, sulfur bacteria, and methanogens.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

Description

Transcript