Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. הגדרת
<ol><li>תרשים זרימה המפרט את כל החומרים, פרוטוקול ניסיוני צעד ושיטה למחיקת חומרים מתכלים צריכים להיכתב במחברת מעבדה ושמר ליד סביבת העבודה הניסיונית.</li>
	<li>יש לעקר סביבות עבודה עם חומר חיטוי מתאים (70% אתנול) ועל הנסיין למתן את סכנת הזיהום על ידי לבישת בגדי מעבדה נקיים המגינים עליהם גם מפני אנומליות חשיפה. בגדים מתאימים כוללים אך אינם מוגבלים לחלוק מעבדה, כפפות לטקס או ניטריל, גוגל, מכונות הנשמה ונעליים סגורות. זה קריטי כדי לשמור על טכניקה אספטית בכל עת.</li>
	<li>הכן 90 מ"ל של 0.45% מלוחים. באמצעות גליל בוגר נקי, למדוד 90 מ"ל של מים סטריליים ולהעביר אותו בקבוקון Erlenmeyer נקי שכותרתו 0.45% מלוחים. שקלו 0.405 גרם נתרן כלורי (סיגמא-אולדריץ' NaCl S9888) והוסיפו אותו לבקבוקון שכותרתו 0.45% מלוחים. מערבבים שוב ושוב עד שאף מבול לא נשאר גלוי.</li>
	<li>עם השלמת, הנסיין צריך לעקר מחדש את כל המשטחים ולהשליך כל אורגניזמים לא רצויים, מלאי דילול, צלחות פטרי, או לולאות חנק חד פעמיות על פי הנחיות OSHA. ניתן להסיר בגדי מעבדה לפני שטיפת ידיים.</li>
</ol>2. הכנה לתקשורת
<ol><li>בחר מדיה המתאימה לטיפוח אורגניזם רצוי. ברוב התרחישים, מרק יאפשר צמיחה חיידקית מספקת. מאז אורגניזמים מפרוטוקול וינוגרדסקי רצויים כאן, טור המורכב סידן פחמתי, גופרית, תאית ובוץ הורכב ונשאר ללא הפרעה במשך 7 ימים. הטור המופרד לחלקים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים.</li>
	<li>בחר מדיום המתאים ל ציפוי האורגניזם של עניין. תוספי של מדיה נוזלית עם אגר כיתה מיקרוביולוגיה מועסק בדרך כלל כסוכן מתגבש. LB בינוני / אגר מספיק בעת קצירת דגימות מאזורים אירוביים, מיקרואורופיליים ואנאירוביים של הטור forenamed. הערה: דגימות מהאזור המיקרואורופילי לא נקצרים עבור הליך זה. עם זאת, אורגניזמים אלה צריכים להיות מעובדים בצנצנות נרות. החדרת נר לתא הטיפוח הזה לפני האיטום יוצרת סביבת חמצן נמוכה המתאימה להתפשטות מיקרואורופילית.</li>
	<li>מאז אנחנו רוצים להכין 250 מ"ל, להשתמש 500 מ"ל (או גדול יותר) צלוחיות Erlenmeyer כדי למנוע boil-over בעת autoclaving. תייג אחד "מרק" והשני "אגר".</li>
	<li>קבע את כמות המדיה הדרושה ליצירת כל פתרון על-ידי ביצוע המלצות הריכוז של היצרן. LB אגר, המשמש כאן, מוכן על ידי שילוב 25 גרם / L עם מים אולטרה pure. נפח של 250 מ"ל שלנו דורש פתרון של 6.25 LB אגר / 250 מ"ל מים. באופן דומה, מרק LB מוכן על ידי שילוב אותו יחס של מרק LB ומים. מאז זה לא בתוספת עם סוכן מתגבש, זה לא להקשיח כאשר מקורר.</li>
	<li>שקול את המדיה ומערבב אותה עם מים בפרופורציות העולות בקנה אחד עם המלצות היצרן. הוסף 6.25 גרם של LB אגר לבקבוקון שכותרתו "אגר", ו 6.25 גרם של מרק LB לבקבוקון שכותרתו "מרק". מוסיפים 250 מ"ל מים אולטרה-תפותיים לכל בקבוקון.</li>
	<li>עטפו רדיד אלומיניום על כל בקבוקון והשתמשו ב-autoclave כדי לעקר את המדיה למשך 15 דקות לפחות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 פסאיי.</li>
	<li>באמצעות כפפה או כרית עמידים בחום, להסיר את הבקבוקונים מן autoclave עם השלמת המחזור ומניחים אותם באמבט מים 40-50 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר הטמפרטורה המתאימה כבר הגיע, לשפוך את התוכן של הבקבוקון שכותרתו "מרק" לתוך 250 מ"ל Erlenmeyer, או בקבוקון עגול התחתון. תייג את הבקבוקון 250 מ"ל "פתרון0".</li>
	<li>להשיג 10, 100mm x 15 מ"מ צלחות פטרי סטריליות ולתייג אותם עם התאריך, שם, סוג המדיה בשימוש ואת אזור העמודה Winogradsky כי אורגניזמים ייקצרו.</li>
	<li>מוציאים את הבקבוקון שכותרתו "אגר" מאמבט המים ומתחילים לשפוך לתוך כל אחת מעשר מנות הפטרי. לא יותר מ 15 מ"ל יש להוסיף לכל מנה. זה יכול להתבצע גם עם pipettor ו 25 מ"ל סרולוגי pipette כדי לשפר את הדיוק. השתמש קצה pipette סטרילי כדי להסיר את כל הבועות הקיימות, ולאחר מכן לכסות עם מכסי הצלחת ולהשאיר להתמצק לילה.</li>
</ol>3. הכנה מדוללת
<ol><li>הכן עשר מבחנה המסוגלות לאחסן 20 מ"ל או יותר בארון תקשורת ולתייג אותן T1-T10. כל מספר צינור עולה בקנה אחד עם גורם הדילול אליו הוא מתאים (כלומר, T4 = 1x10-4 או 0.0001 או 1/10,000th של ריכוז מלאי).</li>
	<li>צינור 9 מ"ל של 0.45% מלוחים לתוך כל אחת מ -10 המבחנות.</li>
	<li>כדורי סרק מלוחים מוכנים כעת לעוקר על ידי autoclave. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות כל אחת מ -10 המבחנות ולאחר מכן העבר אותן למתלה מבחנה תואם אוטומטית. לחטא במשך מינימום של 15 דקות ב 121°C, 15 פסאיי.</li>
	<li>הסר ריק באמצעות כפפות עמידות בחום ולאפשר להתקרר. לכסות ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד הצורך כאשר הצינורות הגיעו לטמפרטורת החדר, או כאשר קריר למגע.</li>
</ol>4. טיפוח אורגניזם היעד
<ol><li>לחסן " פתרון0" עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר או 50 μL של מלאי קפוא. אפשר זמן האורגניזם היעד לשכפל על ידי הצבת " פתרון0" מחוסן לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד (במידת הצורך). (הערה: הבקבוקון צריך להיות מכוסה כדי למנוע זיהום. אם האורגניזם היעד הוא אירובי, השתמש גזה סטרילית ותקעים כותנה כדי למנוע זיהום. אם בוחנים אזורים בעמודה של וינוגרדסקי, פשוט הסירו גרם אחד מכל אזור רצוי (אירובי ואנאירובי למטרות מחקר זה) והיתכנו מחדש ב- T1 לפני שתמשיכו לשלב 5.3.</li>
</ol>5. דילול סדרתי
<ol><li>להשיג את הבקבוקון שכותרתו "מרק מיזים" מן האינקובטור ולנער במרץ.</li>
	<li>Pipet 1 מ"ל של " פתרון0" לתוך המבחנה שכותרתו T1. מערבולת T1. אם בוחנים את Explants ווינגרדסקי, שקול 1 גרם של האזור הרצוי ולהוסיף אותו T1 לפני מערבולת. (הערה: 1 מ"ל משמש כאן לפשטות - ניתן להשתמש גם בנפחים קטנים יותר או גדולים יותר של דילול).</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T1 ולהוסיף אותו מבחנה T2. מערבולת T2.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T2 ולהוסיף אותו במבחנה T3. מערבולת T3.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T3 ולהוסיף אותו במבחנה T4. מערבולת טי-4.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T4 ולהוסיף אותו במבחנה T5. מערבולת T5.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T5 ולהוסיף אותו מבחנה T6. מערבולת T6.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T6 ולהוסיף אותו במבחנה T7. מערבולת T7.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T7 ולהוסיף אותו מבחנה T8. מערבולת T8.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T8 ולהוסיף אותו במבחנה T9. מערבולת טי-9.</li>
	<li>הסר 1 מ"ל מבחנה T9 ולהוסיף אותו במבחנה T10.</li>
</ol>6. ציפוי התפשטות
<ol><li>Pipet 100 μL של מדגם מדולל מ T1 ישירות על צלחת פטרי. שלב זה יכול להיות, אבל לא צריך להיות, חוזר על עצמו עבור כל צינור.</li>
	<li>יש להשיג מוט מתפשט סטרילי וחד פעמי או להבה לחטא מוט התפשטות זכוכית. בתנועה בכיוון השעון/נגד כיוון השעון, החלק האופקי של מוט ההתפשטות כדי לחלק את המדגם באותה מידה בתוך צלחת הפטרי.</li>
	<li>חזור על הפעולה עבור כל אזור בעמודה Winogradsky שיש להעריך.</li>
	<li>לוחות דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אנאירובי.</li>
</ol>7. פסים
<ol><li>בחר דילול מתאים של אורגניזם היעד שלך. לדוגמה, פתרון4 יניב דילול של 1/10,000 של הריכוז הראשוני שלך. בדרך כלל, דילול של 1/1,000th (T3/Solution), 1/1,000,000th (T6/Solution6)ו-1/1,000,000,000th (T9/Solution9) מוערכים כדי למנות חיידקים.</li>
	<li>באמצעות לולאת חנק חד פעמית סטרילית מפלסטיק או לולאת חנק מתכת לשימוש חוזר שהייתה תחת אש במשך לא פחות מ -10 שניות, לטבול את הפתרון הרצוי מהשלב 5. לולאות חקינה מכוילות אמורות להעביר 0.01 מ"ל. (אזהרה: אין לאפשר לולאה להבה ליצור קשר עם חיידקים מיד לאחר הסרת מהחום)</li>
	<li>להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.</li>
	<li>השתמש בלולאת פיקוח חד פעמית חדשה או עיקור מחדש של הלולאה הניתן לשימוש חוזר.</li>
	<li>סובב את הלוח בערך פי1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג.</li>
	<li>שוב, השתמש בלולאה חד פעמית חדשה או עקר מחדש לולאת מתכת לפני סיבוב בפעם האחרונה והפחית את תדר הזיג-זג פעם נוספת. מנמיכים את מכסה צלחת הפטרי.</li>
	<li>חזור על שלבים 7.2 - 7.6 עד שלפחות שלוש מנות פטרי פוספסו במשך שלושה דילולים שונים, באמצעות לולאה חד פעמית חדשה או על ידי הלולאה לשימוש חוזר(איור 2).</li>
	<li>הניחו בין לילה מנות פטרי מפוספסות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. עבור אורגניזמים אנאירוביים, השתמש בתא אירובי.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים ותוצאות
<ol><li>תרבויות נקצרו מהאזורים האוקסיים והאנוקסיים של טור וינוגרדסקי בן 7 ימים. אזורים אלה מתאימים לאנרובים הטרוטרופיים ומחמצן ברזל, בהתאמה.</li>
	<li>מסלקי העמודים היו מדוללים באופן סדרתי לפני פסים או התפשטות על לוחות אגר LB.</li>
	<li>פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו. לוחות התפשטות הניבו תוצאות דומות.</li>
	<li>כדי לחשב CFU/mL או CFU/g, ממוצע מספר המושבות שנספרו משלוש לוחות. הכפל את המספר הממוצע של מושבות על ידי גורם הדילול ולחלק בסכום aliquoted. לדוגמה, אם נספרו בממוצע 65 מושבות על לוחות שחוסנו עם 0.1 מ"ל של פתרון6 (T6) הנוסחה שתוארה בעבר תהיה שווה ל- 650,000,000 יחידות רה-תכליתיות /mL.</li>
	<li>כעת ניתן לבחור מושבות מבודדות מכל צלחת לשימוש בבדיקות העשרה כדי לקבוע את זהות המינים.</li>
</ol>

הספירה החיידקית ובידוד המתח על ידי ציפוי דורש ריכוזים לניהול של אורגניזמים היעד. ציפוי מוצלח מותנה אפוא בדילול סדרתי. ככזה, הטכניקות הנ"ל נשארות אבן הפינה של בדיקה מיקרוביולוגית וניסויים. למרות פשוט על ידי עיצוב, גורמי דילול וטכניקת ציפוי ניתן לשנות על ידי הנסיין כדי לחזק את התוצאות מבלי להתפשר על השלמות של כל שיטה. התוויית ארבעת השלבים של צמיחת חיידקים יכולה להיות מועילה בעת אפיון החיידקים הרצויים. שלבים אלה, עיכוב, יומן, נייח ומוות, מסומנים על ידי שינויים בשכפול חיידקים. שלב ההשהיה כולל צמיחה איטית עקב הסתגלות פיזיולוגית, שלב היומן הוא התקופה של התפשטות מקסימלית הכוללת עלייה מעריכית בתאים בני קיימא, שלב נייח מגיע לאחר מכן בשל מגבלות סביבתיות והצטברויות של רעלים, לפני שלב המוות שבו ספירת התאים מתחילה ליפול. זה יכול להתבצע על ידי דילול סדרתי (או דילול שלב אחד כדי למנוע בלבול) פתרון0 כל שעה במשך סך של 8 שעות, החל בזמן0 (פתרון0 צריך להיות מוחזר אינקובטור רועד לאחר כל דילול). חשב את יומן הרישום10 של CFU/ml עבור דילול יחיד של זמן0 והתוויה בציר ה- Y. חזור על חישוב זה עבור זמןהדגימה 1 (הקפד לחשב CFU / mL באמצעות אותו גורם דילול כמו זמן0). חזור על הפעולה עד בכל פעם (זמן1-Time8) יתווו על ציר ה- X.

דילול סדרתי ו ציפוי: ספירה מיקרוביאלית

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

מקור:ג'ונתןפ. בלייז 1 , אליזבת סוטר1, וכריסטופר פ קורבו1 1 המחלקה למדעי הביולוגיה, מכללת וגנר, דרך הקמפוס 1, סטטן איילנד ניו יורק, 10301
הערכה כמותית של פרוקריוטים יכולה להיות מכבידה בהתחשב בשפע שלהם, נטייתם להתפשטות מעריכית, מגוון מינים באוכלוסייה וצרכים פיזיולוגיים ספציפיים. בנוסף לאתגר זה, הוא הטבע הארבע-פאזי שבו חיידקים משתכפלים (עיכוב, יומן, נייח ומוות). היכולת להעריך במדויק את ריכוז המיקרואורגניזם נחוצה לזיהוי מוצלח, בידוד, טיפוח ואפיון (6). ככזה, מיקרוביולוגים השתמשו בדילול סדרתי וטכניקות ציפוי שונות במשך למעלה ממאה שנה כדי לכמת באופן אמין עומס חיידקי ויראלי בסביבות מעבדה קליניות, תעשייתיות, פרמצבטיות ואקדמאיות (2,4,6). תיאורים של מתודולוגיה זו הופיעו לראשונה בשנת 1883 כאשר המדען והרופא הגרמני רוברט קוך פרסם את עבודתו על סוכנים הגורמים למחלות זיהומיות (2). הטכניקות הידועות מראש של קוך, המכונות לעתים קרובות אבי הבקטריולוגיה המודרנית, הפכו לסטנדרט הזהב לספירת מיקרואורגניזמים, הניתנים לפולחן או אחר, ברחבי העולם.
דילול סדרתי הוא הפחתה שיטתית של ישות ידועה או לא ידועה (solute, אורגניזם, וכו ') באמצעות השעיה מחדש רצופה של פתרון ראשוני (פתרון0) לתוך נפחים קבועים של דילול נוזלי (ריק). החסרים האלה מורכבים בדרך כלל 0.45% מלוחים, אם כי הרכב יכול להיות מגוון (7). בעוד שנסיין יכול לבחור כל אמצעי אחסון עבור כל דילול, זה לרוב כפולה של 10, להקל על הפחתה לוגריתמית של המדגם. לדוגמה, פתרון0 מכיל סך של 100 תאי E. coli מושעים ב 10 מ"ל של מרק מיזיני. אם 1 מ"ל של פתרון0 מוסר ומתווסף 9 מ"ל של מלוחים (דילול1),הפתרון החדש (פתרון1)יכיל 1/10th של הריכוז הראשוני של E. coli. בדוגמה זו, הפתרון החדש (פתרון1) יכיל 10 תאי E. coli. חזרה על תהליך זה על ידי הסרת 1 מ"ל של פתרון1 והוספתו עוד 9 מ"ל של מלוחים (דילול2) יניב פתרון2, המכיל רק תא E. coli יחיד. מכיוון שכל פתרון חדש (9 מ"ל של דילול + 1 מ"ל של פתרון) מכיל סך של 10 מ"ל, אנו יכולים להסיק כי גורם הדילול להפחתה זו הוא 10 או שזה היה דילול סדרתי פי 10 (איור 1). מכיוון שהתחלנו רק עם 100 תאים בדוגמה זו ואנחנו מדללים בגורם של 10, רק שני שלבים נדרשים כדי להגיע לריכוז המינימלי המוחלט של תא אחד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> איור 1: דילול סדרתי של פתרון מניות. 1 מ"ל aliquot של פתרון המניה (פתרון0) מתווסף צינור 1 אשר מכיל 9 מ"ל של 0.45% מלוחים (dilent1); המוצר של תערובת זו הוא פתרון1. חזור על ידי aliquoting 1 מ"ל של פתרון חדש שנוצר1 והוספתו צינור 2. Aliquoting ו resuspension ממשיך בצורה זו עד הצינור הסופי הוא הגיע, דילול ריכוז המניה על ידי גורם של 10 כל אחד עם כל צעד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
דילול סדרתי הוא הטכניקה הפשוטה ביותר להשגת ריכוזים לניהול של אורגניזם רצוי והוא משלים פסים של צלחת פטרי והתפשטות, רק שתיים מטכניקות ציפוי רבות המשמשות מיקרוביולוגים. יתרון זה של גישה זו הוא כי הנסיין יכול לקצור זנים טהורים של מין אחד או זנים נפרדים מאוכלוסייה מעורבת (7). פסים מתבצעים על ידי החדרת אורגניזם למדיום מוצק (בדרך כלל מורכב אגרוז) כי הוא יגדל על אם החומרים המזינים המתאימים זמינים. ניקוי עדין של לולאת חנק סטרילית על פני המדיום (כך שיישאר פס עדין) בתבנית סינוסואידית נוקשה, תפיץ את האורגניזם באופן פרופורציונלי לתדירות צורת הגל של הנסיין. חלוקת צלחת הפטרי לשליש או לרבעים (רצף רבעים) והפחתת התדירות של כל פס כאזור חדש של המנה נכנס בהדרגה להפחית את מספר מיקרואורגניזמים שיכולים לכבוש את האזור הזה, לייצר מושבות בודדות במקום דשא חיידקי בלתי ניתן לערעור. ציפוי ממרח אינו מדלל בנוסף דגימות; מפיץ זכוכית סטרילי משמש להפצת עליקוט של מדיית השעיה על פני צלחת פטרי שלמה(איור 2). המושבות הגדלות על צלחת ההתפשטות נובעות מתא יחיד וניתן לספור כל מושבה בצלחת כדי להעריך את מספר היחידות היוצרות מושבה למיליליטר (CFU) בהשעיה נתונה, המיוצגת כ- CFU / mL (6) (איור 3) אגר רך וציפוי משוכפל הם וריאציות של הטכניקות הנ"ל ומאפשרים בידוד של בקטריופאז 'והקרנה מוטנטית, בהתאמה (1,7).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> איור 2: צלחת פסים לספירת חיידקים ובידוד מתחים. סמן את תחתית צלחת הפטרי עם פרטי זיהוי (שם חיידק, תאריך, מדיה) וחלק לשליש. לאחר בחירת דילול מתאים של מדגם המלאי, לקחת לולאת חנק סטרילית (חד פעמית או להבה) ולהטביע אותו במבחנה (כאן, T3). להעלות מעט את כיסוי צלחת פטרי בצד אחד, כך רק לולאה מכחיק יכול לגשת אגר. גלה את הלולאה המחוסנת על פני החלק העליון של התקשורת בצורה זיג-זג נזהר לא להתפשר על אגר. סובב את הלוח בערך פי1/3 (~ 118°) והפחית את תדירות תנועת זיג-זג. סובב בפעם האחרונה והפחת את תדירות הזיג-זג פעם נוספת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> איור 3: למרוח ציפוי. גרם אחד של האזור האירובי היה תוחם מחדש ב- T1 ולאחר מכן מדולל באופן סדרתי. זכוכית סטרילית או מוט מתפשט חד פעמי פלסטיק משמש להפצת אינוקולום בכל מנה. זה חזר על עצמו עם 1 גרם של האזור אנאירובי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כמו בדילול סדרתי, קנה מידה לוגריתמי משמש כדי לבטא ריכוז אורגניזמי. ניתן למנות ידנית את מספר המושבות הגדלות בצלחות פטרי סטנדרטיות בגודל 100 מ"מ x15 מ"מ (או אוטומטיות בעזרת עיבוד חישובי) על ידי זיהוי אשכולות מבודדים של צמיחה. ספירות הכוללות פחות מ- 30 או יותר מ- 300 צריכות להיות מוגדרות כמעטות מכדי לספור (TFTC) או רבות מכדי לספור (TNTC), בהתאמה. במקרה של האחרון, דילול סדרתי צריך להתבצע כדי להפחית את הריכוז לפני restreaking צלחת פטרי חדשה. ממוצע מספר המושבות העצמאות שזוהו משלוש מנות פטרי נפרדות והכפלת הממוצע על ידי גורם הדילול יניבו CFU / mL; התווייתיומן 10 של CFU / mL נגד הזמן תחשוף את זמן הדור הממוצע של האורגניזם (7).

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

לפעמים, כדי לזהות ולחקור חיידקים אנחנו צריכים קודם כל לבודד ולהעשיר אותם מדגימה. לדוגמה, דגימות שהתקבלו מעמודת וינוגרדסקי הן מעורבות, כלומר הן מכילות מינים או זנים רבים של חיידקים, כך שחקר חיידק בודד או ספירת הסוגים השונים הקיימים יכולים להיות מאתגרים. לשם כך, טכניקות דילול וציפוי סדרתיות משמשות בדרך כלל כדי לכמת באופן אמין את העומס החיידקי ולבודד מושבות בודדות. דילול סדרתי הוא תהליך שבאמצעותו ריכוז האורגניזם, חיידקים בדוגמה זו, מופחת באופן שיטתי באמצעות השעיה עוקבת בכמויות קבועות של מדלל נוזלי. בדרך כלל נפח המדלל הוא כפולה של 10 כדי להקל על הפחתה לוגריתמית של אורגניזם הדגימה. לדוגמה, גרם אחד של משקעים מוסר תחילה מאזור העניין של וינוגרדסקי ומתווסף ל-10 מיליליטר של מדיום נוזלי מתאים. לאחר מכן, מיליליטר אחד של דילול ראשון זה מתווסף לצינור אחר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום. ניתן לחזור על התהליך עד שהכינו מספר ריכוזים שונים של חיידקים. דילול סדרתי הוא המפתח לספירת חיידקים בדוגמה זו, מכיוון שדגימות מעורבות מעמודת וינוגרדסקי מכילות מספר לא ידוע, לעתים קרובות גדול, של חיידקים. לאחר מכן, ציפוי פסים וציפוי מפוזר מאפשרים בידוד וספירה של חיידקים בתוך דגימה, בהתאמה. פסים מושגים על ידי הכנסת דגימה מדוללת לחלק אחד של המדיום המוצק בתוספת חומר מזין, המחולק לשלישים. לאחר מכן מורחים את החיסון הזה על כל שליש של הצלחת בתבנית זיג-זג. כאשר חלקים שונים של הצלחת מפוספסים, חוצים מהדגימה הקודמת פעם אחת בלבד, הדגימה נמרחת דק יותר. המשמעות היא שייתכן שתצטרך לפס רק מדילול אחד כדי להשיג מושבות בודדות בסעיפים המאוחרים יותר. לאחר הדגירה, הלוחות המפוספסים מאפשרים תצפיות על מורפולוגיה של המושבה, מידע שיכול לעזור להבדיל בין מיני חיידקים שונים. לחלופין, אם המטרה העיקרית היא ספירת החיידקים בדגימה, ניתן להשתמש בציפוי מפוזר. בציפוי מפוזר, כמות של דגימה בודדת מפוזרת באופן שווה על פני כל שטח המדיום המוצק. בדרך כלל, מכיוון שאיננו יודעים את מספרי החיידקים בדגימה המעורבת, נוצרת צלחת פיזור לכל אחד מהדילולים או מדגם מייצג שלהם. לאחר הדגירה, ניתן לבצע ספירה באמצעות לוחות פרוסים אלה. יש להשליך כל צלחות עם ספירת מושבות נמוכה מ-30, מכיוון שספירה קטנה נתונה לשגיאות גדולות יותר. באופן דומה, יש להשליך כל ספירה מעל 300 מכיוון שצפיפות וחפיפה של מושבות עלולות להוביל להערכת חסר של ספירת המושבות. אם ספירת המושבה של כל אחת מהמנות הנותרות הללו נרשמת ומוכפלת במקדם הדילול, ולאחר מכן מחולקת בנפח המצופה, זה מניב את היחידות היוצרות מושבה, או CFUs, למיליליטר של תרחיף. בסרטון זה תלמדו כיצד להעריך באופן איכותי וכמותי דגימה המכילה חיידק ידוע, ואת הקהילות המיקרוביאליות הכלולות באזורים שונים של עמוד וינוגרדסקי באמצעות דילול סדרתי, ציפוי מפוזר וציפוי פסים. ראשית, לבשו כל ציוד מגן אישי מתאים כולל מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. לאחר מכן, יש לעקר את סביבת העבודה עם 70% אתנול ולנגב את פני השטח. לאחר מכן, אספו שתי צלוחיות ארלנמאייר של 500 מיליליטר וסמנו מרק אחד ואת האגר השני. להכנת תמיסת אגר LB, מערבבים כ -6.25 גרם אגר LB, שלושה גרם אגר טכני ו -250 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק המסומן אגר. לאחר מכן, הכינו מרק LB על ידי שילוב של 2. 5 גרם מדיה LB ו-100 מיליליטר מים מזוקקים במרק המסומן בבקבוק. לאחר חיטוי הצלוחיות השתמשו בכפפה עמידה בחום כדי להוציא את הצלוחיות מהחיטוי ולהניח אותן באמבט מים של 40 עד 50 מעלות צלזיוס. לאחר שהצלוחיות הן 50 מעלות צלזיוס, הכינו בזהירות שלוש תמיסת המרק של 100 מיליליטר וסמנו כל תמיסת אליקוט אפס. לאחר מכן, אספו 10 צלחות פטרי סטריליות ותייגו אותן עם התאריך, השם, סוג המדיה שבה נעשה שימוש ואזור עמוד וינוגרדסקי שממנו ייאספו האורגניזמים. פיפטה 15 מיליליטר אגר מבקבוק האגר לכל צלחת פטרי. לאחר מכן, השתמש בקצה הפיפטה כדי להסיר בועות, החזר את מכסי הצלחת למקומו ואפשר להם להתמצק על גבי הספסל למשך הלילה. למחרת, נגב את הספסל עם 70% אתנול. לאחר מכן, סמן 10 מבחנות 20 מיליליטר T1 עד T10 והנח אותן במתלה. פיפטה תשעה מיליליטר של 0.45% מי מלח לכל צינור. כעת, כסו כל אחת מ-10 המבחנות באופן רופף עם הכובעים שלהן והעבירו אותן למתלה מבחנה תואם חיטוי. לאחר השלמת המחזור, הסר את החסר במי מלח בעזרת כפפות עמידות בחום והניח להם להתקרר. אחסן את הצינורות בטמפרטורת החדר עד שהם מגיעים לכ-22 מעלות צלזיוס. כדי לטפח אורגניזם מטרה ידוע, E. coli בדוגמה זו, חסנו 100 מיליליטר של תמיסה אפס עם מושבה אחת מצלחת מפוספסת בעבר. לאחר מכן, כסו את הצינור ודגרו אותו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כדי להעריך את האזורים של עמודת וינוגרדסקי, הוסף כגרם אחד של חומר מהאזור האירובי ל-T1 והשהה מחדש על ידי מערבולת. לאחר מכן, חזור על תהליך זה עם גרם אחד של חומר מהאזור האנאירובי. הוציאו את הצינור המכיל תמיסה אפס מחוסנת ב-E. coli מהאינקובטור ונערו אותו. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד מהתמיסה לתוך מבחנה T1 ומערבולת לערבוב. הסר מיליליטר אחד של תמיסה מ- T1 והעביר אותו ל- T2, מערבולת לערבב. חזור על תהליך זה דרך צינור T10. כדי להעריך את האזורים האירוביים והאנאירוביים של עמוד וינוגרדסקי, הסר מיליליטר אחד של תמיסה מכל אחד מצינורות ה- T1 שהוכנו בעבר והעביר אותו לצינורות T2 המתאימים. לאחר מכן, המשך בדילולים הסדרתיים דרך צינורות T10 כפי שהודגם קודם לכן. כדי לפזר צלחת, פיפטה 100 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת מכל צינור T3 על צלחת הפטרי המתאימה. לאחר מכן, השתמש במוט פיזור סטרילי כדי לפזר בעדינות את הדגימה על צלחת הפטרי ולהחליף את מכסה הצלחת. חזור על תהליך זה עבור דילול T6 ו-T9, כפי שהודגם קודם לכן. דגרו את הצלחות המכילות אורגניזמים אירוביים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. דגרו את הצלחות המכילות אורגניזמים אנאירוביים בתא אנאירובי המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת הסר את לוחות הדילול T3, T6 ו-T9 מהאינקובטור ומהתא האנאירובי והעביר אותם למשטח הספסל. בעבודה עם צלחת אחת בכל פעם, החלק לולאת חיסון סטרילית על פני החלק העליון של המדיה בתבנית זיג-זג. לאחר מכן, החזר את מכסה צלחת הפטרי. לאחר מכן, סובב את הצלחת ב -1/3 ועקר את הלולאה כדי להפחית את תדירות דפוס הזיגזג שנעשה בעבר. שוב, לאחר עיקור הלולאה, סובב את הצלחת ב-1/3, הפחת את תדירות דפוס הזיגזג בפעם האחרונה והחלף את המכסה. חזור על שיטת פסים זו עבור הלוחות הנותרים, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר מכן, הניחו את הלוחות המפוספסים המכילים אורגניזמים אירוביים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואת הלוחות המפוספסים המכילים אורגניזמים אנאירוביים בתא אנאירובי המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. תרביות נאספו מהאזורים האירוביים והאנאירוביים של עמוד וינוגרדסקי בן שבעה ימים. לאחר מכן, התרביות דוללו באופן סדרתי לפני הפסים וההתפשטות על לוחות אגר LB. פסים חשפו אוכלוסייה מעורבת מכל אחד מאזורי וינוגרדסקי שהוערכו, ולוחות הפיזור הניבו תוצאות דומות. צלחת מפוספסת מאוכלוסייה מעורבת תביא למושבות חיידקים בצורות, גדלים, מרקמים וצבעים שונים. לעומת זאת, הלוחות המפוספסים והמפוזרים שהכילו את האורגניזם הידוע, E. coli, הדגימו אוכלוסייה הומולוגית. בדרך כלל, עדיף לחשב CFUs למיליליטר באמצעות ספירת המושבה הממוצעת של שלוש צלחות המפוזרות עם אותו דגימה וגורם דילול. הכפל את המספר הממוצע של המושבות במקדם הדילול וחלקו בכמות הנקובה. לבסוף, ניתן להשתמש במושבות מבודדות שנבחרו מכל צלחת במבחני העשרה נוספים לקביעת זהות המינים.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Microbiology

מיקרוביולוגיה

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript