Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Louisiana Student Standards for Science

High School

Life Sciences

from-molecules-to-organisms-structures-and-processes

From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. בדיקות אפסילומטר (בדיקות אלקטרוניות)
<ol><li>
הגדרת
	<ol>
<li>ללבוש כפפות וחלוק מעבדה</li>
		<li>הכן את סביבת העבודה על ידי עיקורו באמצעות 70% אתנול</li>
		<li>לאסוף מולר-הינטון צלחות אגר (לוחות MHA)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת תקן עגמת מקפרלנד מס' 0.5
	<ol>
<li>הכן פתרון של 1% של בריום כלוריד (BaCl2): יש להוסיף 1 גרם בריום כלוריד נטול מים (BaCl2)במים מזוקקים ב-100 מ"ל. מערבולת היטב.</li>
		<li>הכן פתרון של 1% של חומצה גופרתית (H2SO4): הוסף 1 מ"ל של H מרוכז2SO4 ב 99 מ"ל של מים מזוקקים. מערבולת היטב.</li>
		<li>הכן תקן עכוז מקפרלנד מס ' 0.5: 50 μL BaCl2 פתרון ב 5 מ"ל של 1% H2SO4 פתרון. מערבולת הפתרון היטב כדי לקבל השעיה עגבת.</li>
		<li>שמור על תקן עכוז מקפרלנד מס' 0.5 בצינור מכוסה בנייר כסף. יש לאחסן ב-25°C למשך 6 חודשים לכל היותר. מערבולת גם לפתרון הומוגני לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת לוחות MHA
	<ol>
<li>לגרד סטרפטוקוקוס קבוצה G חיידקים מצלחת אגר דם באמצעות לולאה סטרילית. מערבבים לתוך 1mL של תמיסת מלח, מערבולת להשעיה של החיידקים.</li>
		<li>השווה את ההשעיה לתקן מקפרלנד מס '0.5 כדי להשיג את אותה עכום על מנת שיהיה לו גודל אינוקולום זהה במהלך הניסויים. התאם את הריכוז באמצעות תמיסת מלח או חיידקים נוספים.</li>
		<li>לחסן את לוחות MHA באמצעות אפליקטור כותנה סטרילי. ספוגית הצלחת בעדינות כדי לכסות את פני השטח. המשך באחת משלוש השיטות המתוארות להלן (1.4-1.6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בדיקת עמידות לאנטיביוטיקה אחת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G או גנטמיצין<ol>
<li>הניחו רצועת מבחן אלקטרוני (פניצילין G או גנטמיצין) במרכז צלחת MHA(איור 1 A,B).</li>
		<li>דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.</li>
		<li>קרא את התוצאות. מיקרופון נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת(איור 1 C,D).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> איור 1: מבחן אלקטרוני יחיד. מיקום של רצועת בדיקה אלקטרונית של A) פניצילין G ו- B) גנטמיצין על צלחת אגר מולר הינטון מכוסה במושבות חיידקיות של קבוצה G סטרפטוקוצ'י לפני (A ו- B) ואחרי (C ו- D) דגירה לילה ב 37 ° C 5% CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="5"><li>
סינרגיה בוחנת גישה צולבת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G וג'נטמיצין.<ol>
<li>מניחים שתי רצועות בדיקה אלקטרונית עם אנטיביוטיקה שונה (למשל פניצילין G וגנטמיצין) על צלחת MHA מחוסנת במבנה צולב.<ol>
<li>לקבלת התוצאות המדויקות ביותר, כוון למקם את הצלב בזווית של כ-90° בצומת בין המאזניים בערכי המיקרופון שלהם, שנקבעו בעבר בבדיקת עמידות לאנטיביוטיקה בודדת (איור 2 A).</li>
			<li>שים לב כי ברגע שהרצועות ממוקמות על צלחת אגר, הם לא צריכים להיות מועברים, שכן כמה אנטיביוטיקה אולי כבר נספג על ידי הצלחת. לכן, מתאים יותר לשמור על הרצועות בזווית מעט לא נכונה (למשל 85°) ועד 1-2 מ"מ מערך המיקרופון בפועל. מומלץ להפעיל את הניסוי משולש כדי להפחית את הבעיה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.</li>
		<li>קרא את התוצאות. MIC נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת בכל רצועת מבחן אלקטרוני בהתאמה (איור 2 B).</li>
		<li>השתמש בנוסחה עבור ריכוז מעכבי שברים (FIC) (משוואה 1) כדי לקבוע סינרגיה.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> איור 2: זיהוי סינרגיזם - בדיקה צולבת. תוצאות של בדיקת סינרגיה מיקרוביאלית של מיקרופון של פניצילין G וג'נטמיצין על קבוצת סטרפטוקוקוס G לפני (A)ואחרי (B) דגירה לילה ב 37 ° C 5% CO2. זווית של 90° נוצרת בין שני ערכי MIC בודדים (פניצילין G: 0.094 מיקרוגרם / מ"ל, גנטמיצין: 8 מיקרוגרם / מ"ל). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="6"><li>
סינרגיה בודקת גישה לא צולבת. קבוצת סטרפטוקוקוס G, התנגדות לפניצילין G וג'נטמיצין.<ol>
<li>מקם את רצועת הבדיקה האלקטרונית במרכז צלחת MHA(איור 3 A,D).</li>
		<li>סמן היכן היה ערך ה- MIC שנקבע בעבר בכל רצועה.</li>
		<li>דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>יש להשליך את רצועת הבדיקה האלקטרונית עבור כל צלחת MHA(איור 3 B,E).</li>
		<li>מקם את רצועת הבדיקה האלקטרונית השנייה (המכילה אנטיביוטיקה שונה) על שטח הרצועה שהוסרה מוקדם יותר בהתאמה, כך שערכי המיקרופון שלהם יתאימו לסימן ומיושרים.</li>
		<li>דגירה במשך 18-20 שעות, 37°C.</li>
		<li>קרא את התוצאות. מיקרופון נמדד כאזור העיכוב שחוצה את רצועת הבדיקה האנטיביוטית המדורגת בכל רצועת מבחן אלקטרוני בהתאמה (איור 3 C, F).</li>
		<li>על מנת לקבוע סינרגיה, הנוסחה לריכוז מעכבי שברים (FIC) משמשת (משוואה 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> איור 3: זיהוי סינרגיזם - בדיקה לא צולבת. תוצאות של בדיקת סינרגיה מיקרוביאלית של MIC של פניצילין G וג'נטמיצין על סטרפטוקוקוס קבוצה G. A) רצועת גנטמיצין (8 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי קבוצת סטרפטוקוקוס חיידקים G, B) הסרת רצועת גנטמצין, C) משולב גנטמיצין / פניצילין G רצועת (0.094 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי קבוצת סטרפטוקוקוס חיידקים G, D) פניצילין G רצועה (0.094 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז), E) הסרת רצועת פניצילין G, F) רצועת פניצילין G / גנטמיצין משולבת (8 מיקרוגרם / מ"ל מרוכז) על גבי חיידקי קבוצת סטרפטוקוקוס G. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. בדיקת מרק
<ol><li>
הגדרת
	<ol>
<li>ללבוש כפפות וחלוק מעבדה</li>
		<li>הכן את סביבת העבודה על ידי עיקורו באמצעות 70% אתנול</li>
		<li>לאסוף 15mL מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD (MH-F)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(אופציונלי) ביצוע בדיקה אלקטרונית [פרוטוקול 1] כדי לקבוע את המיקרופון באמצעי מוצק
	<ol>
<li>בעוד אופציונלי, ידע כזה יאפשר עיצוב ניסיוני טוב יותר (למשל ריכוזי אנטיביוטיקה שנוספו יכול להיות מתוכנן להקיף את ערך MIC שנקבע מהצלחת), שיפור הסיכויים של ניסוי מוצלח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מכין תימוכין חיידקי. כאמור לעיל, ריכוז חיידקים ניתן להעריך על ידי מדידות OD nm או תקני עכוז מקפרלנד<ol>
<li>
שיטת OD600 ננומטר
		<ol>
<li>להשיג השעיה חיידקית עם ריכוז חיידקי מבוסס</li>
			<li>לדלל את התרבות מרק MH-F כדי להשיג OD600 של 0.003</li>
		</ol>
</li>
		<li>
שיטת העקשנות של מקפרלנד
		<ol>
<li>שים 15 מ"ל מרק MH-F בצינור סטרילי.</li>
			<li>לחסן את מרק MH-F עם חיידקים (מצלחת) לרמת מקפרלנד. מערבולת הפתרון במרץ. יוצקים את הפתרון לצלחת פטרי סטרילית.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת אנטיביוטיקה
	<ol>
<li>לקבוע את הריכוז של אנטיביוטיקה הרצוי<ol>
<li>זהה את ערך המיקרופון ממבחן E (לדוגמה 0.125 מיקרוגרם /מ"ל עבור פניצילין G ו- 8 מיקרוגרם / מ"ל עבור גנטמיצין)</li>
			<li>הכפל את ערך MIC צלחת אגר ב 24-27, המתאים ארבע-שבע 2x דילול טורי. זה יהיה הריכוז ההתחלתי של אנטיביוטיקה. (לדוגמה עבור פניצילין G, שבעה דילול טורי 2x: 0.125 מיקרוגרם / מ"ל x 27 = 16 מיקרוגרם / מ"ל; עבור גנטמיצין, ארבעה דילול טורי 2x 8 מיקרוגרם / מ"ל x 24 = 128 מיקרוגרם / מ"ל</li>
			<li>הכפל את הערך ההתחלתי הרצוי 100x על מנת לקבוע ליצור ריכוז מלאי של אנטיביוטיקה (למשל מניות של 1.6 מ"ג / מ"ל פניצילין G ו 12.8 מ"ג / מ"ל גנטמיצין)</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכן ריכוז מלאי אנטיביוטי פי 100 בהתאם<ol>
<li>להמיס את האנטיביוטיקה במים autoclaved 10mL, ומערבולת כדי ליצור פתרון מלאי (למשל 16 פניצילין G ו 128 מ"ג גנטמיצין כדי ליצור את המניות לעיל)</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הוספת חיידקים לבארות מיקרו-לוח
	<ol>
<li>Aliquot 200 מרק MH-F המכיל אינוקולום חיידקים לבארות ב -3 השורות הראשונות של צלחת microtiter 96 טוב לניסוי משולש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הוסף אנטיביוטיקה לבארות מיקרו-לוח
	<ol>
<li>הוסף 200 מרק MH-F נוסף של μL עם חיידקים לעמודה הראשונה של בארות (A1, B1, C1) כדי להביא את הנפח הכולל ל 400 μL.</li>
		<li>הוסף 4 μL של ריכוז מלאי של אנטיביוטיקה לעמוד הראשון של בארות. מאז המדגם מכיל 400 μL זה יגרום דילול 100x של האנטיביוטיקה.</li>
		<li>ליצור דילול סדרתי 2x על ידי העברת 200 חיידקים μL / אנטיביוטיקה מ A1 ל- A2, כל הדרך A11. הצינור במרץ בין הדילולים. חזור על השלב עבור שורות נוספות.</li>
		<li>הסר 200 μL מהעמודה 11 כך אמצעי האחסון הסופי בכל בארות הם 200 μL.</li>
		<li>השאירו את העמודה האחרונה (A12, B12, C12) ללא אנטיביוטיקה, כפקדים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
קביעת ערכי מיקרופון
	<ol>
<li>לדגור על צלחת microtiter 96-well במשך 24 שעות ב 37°C מבלי לרעוד.</li>
		<li>ערך המיקרופון מוגדר כבאר האחרונה בסדרת הדילול שלא מציגה צמיחה נראית לעין של חיידקים (איור 4). עם זאת, ניתן לתת אמון בערך זה רק אם גודל ההסתמכות המקורי היה נכון.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> איור 4: קביעת מיקרופון על ידי דילול מרק. מיקרופון מוגדר כאן כבאר האחרונה שמציגה בהירות (ללא צמיחה של חיידקים) לפני שהיא משנה את העקרנות. שורה הן כפילויות של ערך המיקרופון של פניצילין G ושורה הן כפילויות של ערך המיקרופון של גנטמיצין, הן לעומת איזולט של קבוצת סטרפטוקוקוס G. A) תוצאה ניסיונית בפועל, ב) פרשנות סכמטית של הערכים מ- A (אפור = ללא צמיחה; לבן = צמיחה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> איור 5: הליך סכמטי של סדרת דילול לספירת ריכוז החיידקים המקורי. דילול בוצעו כמתואר (20 μL מדולל ב 180 μL עבור סדרת דילול 10x), ולאחר מכן 10 μL מן השורות A-H מצופים על שתי לוחות אגר דם נפרדים כפי שצוין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="8"><li>
קביעת גודל ההסתה המקורי הערה: בדיקות מיקרו-ברות רגישות מאוד לגודל ההנוקולום המקורי שבו נעשה שימוש. גודל אינוקולום מוגזם ייתן תוצאה חיובית כוזבת, שכן האנטיביוטיקה שנוספה לא תוכל לעכב את הצמיחה יותר ביחס זה. לכן, זה קריטי כדי לוודא כמה חיידקים נוספו microwells. בעוד שהנתונים לא יהיו זמינים בנקודת הניסוי (בשל הצורך בדגורה של 24 שעות) הוא ישמש כבקרה. אם מספר החיידקים המוספים נמצא בטווח הריכוז המוצהר, ניתן לסמוך על ערכי המיקרופון. אם ההנמקולום היה גבוה מדי או נמוך מדי, יש לחזור על הניסוי.<ol>
<li>
לדלל את החיידקים באופן סדרתי
		<ol>
<li>הכן צלחת microtiter 96 היטב כדי לדלל את ריכוז החיידק המקורי על מנת לקבוע את גודל inoculum. האופטימלי הוא נפח של 200 μL עם 105-6 חיידקים. כדי לבצע את הדילולים, הראשון aliquot 180 μL סטרילי PBS לכל באר B-H (ב משולש 1-3).</li>
			<li>לאחר מכן, להוסיף 100 μl של פתרון חיידקי A (משולש 1-3).</li>
			<li>ליצור דילול סדרתי 10x (במשולש) על ידי העברת 20 חיידקים μl מ A ל- B, pipet במרץ. חזור על השלבים עבור C-H.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
צלחת דילול חיידקי לקביעת גודל inoculum
		<ol>
<li>סמנו לוחות אגר דם לפי איור 5.</li>
			<li>העבר 10 μL מהה בדילול הסדרתי לצלחת לפי איור 5.</li>
			<li>לדגור על הצלחת ב 37°C במשך 20-24 שעות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
קבע את גודל האינוקולום החיידקי
		<ol>
<li>ספרו את מספר החיידקים בנקודות בתוך 5-50 מושבות(איור 6).</li>
			<li>חשב את גודל inoculum הראשוני על ידי חישוב הממוצע של דגימות משולש, להכפיל על ידי גורם דילול (למשל 10x עבור דגימות B, 100x עבור דגימות C, 1000x עבור דגימות D, וכו ') ולאחר מכן על ידי 100 כדי לפצות על נפח התצפית של 10 μL, וכתוצאה מכך גודל inoculum cfu / mL. אם ההסתמכות היא בתוך 105-6 cfu/mL ניתן לתת אמון בנתוני ה- MIC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> איור 6: קביעת גודל ההסתה. חיידקים שחוסנו על פי איור 5 דוגר במשך 20-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן נספרו. לשורה D יש מספר טוב של מושבות לספור (למשל 5-50). דגימות ב- A אינן מדוללות, B מדולל 10x, C מדולל 100x, ו- D מדולל 1000x, ורק 10 μL מצופה בכל נקודה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאותית כלל עולמית. על מנת לקבוע מנגנוני התנגדות של חיידקים, שיטות בדיקה לסינרגיה ואנטגוניזם עם אנטיביוטיקה שונה היא קריטית. שיטת הבדיקה האלקטרונית מהירה, קלה לשכפול, וניתן להשתמש בה כדי לחקור כל פוטנציאל סינרגטי של טיפולים משולבים. ניתן להעריך גם את שיטת דילול המרק כדי לחזות פעילות חיידקית. על מנת לחקור את מנגנוני ההתנגדות של חיידקים שונים, הידע של אינטראקציות אנטיביוטיות סינרגטיות ואנטגוניסטיות הוא חיוני. שילוב אנטיביוטיקה עשוי להיות אסטרטגיה כדי להגביר את יעילות הטיפול להתמודד עם עמידות ל...

בדיקת רגישות אנטיביוטית: בדיקות אפסילומטר לקביעת ערכי המיקרופון של שתי אנטיביוטיקות והערכה של סינרגיה אנטיביוטית

מקור: אנה בלכברג1, רולף לוד1 1 המחלקה למדעים קליניים לונד, החטיבה לרפואת זיהומים, המרכז הביו-רפואי, אוניברסיטת לונד, 221 00 לונד שבדיה
הידע על האינטראקציות בין אנטיביוטיקה לחיידקים חשוב בהבנת האופן שבו חיידקים מפתחים עמידות לאנטיביוטיקה. בשנת 1928, אלכסנדר פלמינג גילה פניצילין, אנטיביוטיקה המפעילה את תפקודה האנטיבקטריאלי על ידי הפרעה להתחדשות דופן התא (1). אנטיביוטיקה אחרת עם מנגנוני פעולה מגוונים התגלו לאחר מכן, כולל תרופות המעכבות שכפול DNA ותרגום חלבונים בחיידקים; עם זאת, לא פותחו אנטיביוטיקה חדשה בשנים האחרונות. העמידות לאנטיביוטיקה הנוכחית גדלה, וכתוצאה מכך מחלות זיהומיות חמורות שלא ניתן לטפל בהן ביעילות (2). כאן, אנו מתארים מספר שיטות להערכת עמידות לאנטיביוטיקה באוכלוסיות חיידקים. כל אחת מהשיטות האלה עובדת, ללא קשר למנגנון הפעולה של האנטיביוטיקה המשמשת, כי מוות חיידקי הוא התוצאה הנמדדת. עמידות לאנטיביוטיקה מופצת לא רק במהירות במיוחד באמצעות הגדרות בית החולים, אלא גם ברחבי החברה. על מנת לחקור אמצעי התנגדות כאלה, פותחו שיטות שונות כולל מבחן אפסילומטר (מבחן E) ומבחן דילול מרק (3).
מבחן E הוא שיטה מבוססת היטב והוא כלי חסכוני המכמת נתוני ריכוז מעכבות מינימלי (MIC), הריכוז הנמוך ביותר של מיקרוביאלית המעכבת צמיחה גלויה של מיקרואורגניזם. בהתאם לזן החיידקי והאנטיביוטיקה המשמשת, ערך המיקרופון יכול להשתנות בין תת מיקרוגרם / מ"ל &gt;1000 מיקרוגרם / מ"ל (4). הבדיקה האלקטרונית מתבצעת באמצעות רצועת פלסטיק המכילה שיפוע אנטיביוטי מוגדר מראש, המוטבע בסולם הקריאה MIC ב- μg/ mL. רצועה זו מועברת ישירות על מטריצת אגר כאשר מוחל על צלחת אגר מחוסנת. לאחר הדגירה, אזור עיכוב אליפטי סימטרי נראה לאורך הרצועה כמו צמיחה חיידקית נמנעת. מיקרופון מוגדר על ידי אזור העיכוב, שהוא נקודת הקצה שבה האליפסה מצטלבים עם הרצועה. שיטה נפוצה נוספת לקביעת MIC היא שיטת דילול המיקרו-ברות. דילול Microbroth משלב ריכוזים שונים של חומר מיקרוביאלית הוסיף למדיום מרק המכיל חיידקים מחוסנים. לאחר הדגירה, MIC מוגדר הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה המונע צמיחה גלויה (5). זוהי גם שיטה כמותית וניתן להחיל אותה על מספר חיידקים. חסרונות של שיטה זו כוללים את האפשרות של שגיאות בעת הכנת הריכוזים של ריאגנטים ואת המספר הגדול של ריאגנטים הנדרשים לניסוי. מדידת עמידות לאנטיביוטיקה היא הכרחית הן מנקודת מבט קלינית והן מבחינה מחקרית, ושיטות במבחנה אלה של חקירת התנגדות נדונות ומציגות לראווה להלן.
ניתן ליישם את פרופיל ההתנגדות לחיידק מסוים על מנת לייעל את הטיפול האנטיביוטי כדי לקבוע אם המטופל יפיק תועלת מטיפול משולב לעומת טיפול יחיד. לשימוש ביותר מאנטיביוטיקה אחת בבת אחת, חובה לדעת את האינטראקציות שלהם זה עם זה ואם יש להם אפקט תוסף, סינרגטי או עוין. אפקט תוסף ניתן לראות כאשר ההשפעה המשותפת של האנטיביוטיקה שווה את העוצמה של אנטיביוטיקה בודדים הניתנים במינון שווה. סינרגיה בין אנטיביוטיקה, לעומת זאת, קיימת כאשר ההשפעה המשותפת של האנטיביוטיקה חזקה יותר מאשר אם התרופה תינתן לבד (6). החלת שילובים של טיפול מיקרוביאלי משמשת כדי למנוע את התרחשות ההתנגדות מיקרוביאלית ובכך לשפר את ההשפעה של הטיפול האנטיביוטי הפרטני (7). ידע באנטגוניזם חשוב גם כדי למנוע שימוש מיותר בשילובים מיקרוביאליים. מתודולוגיית הבדיקה האלקטרונית מציעה דרכים פשוטות ומספר דרכים לקבוע סינרגיה ואנטגוניזם אפשריים בין סוכנים מיקרוביאליים שונים. על מנת להתמודד עם התפשטות של פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה, ידע על מנגנונים סינרגטיים ואנטגוניסטיים אפשריים של אנטיביוטיקה מסוימת חשוב וכתוצאה מכך יעילות קלינית ונאבקים בעמידות רב-דרוגית.
ניתן לחלק את קביעת סינרגיה באמצעות בדיקות אלקטרוניות לשתי גישות רחבות: בדיקות צולבות ולא צולבות. בעוד ששני מבחני הסינרגיה מסתמכים על הידע הקודם של ערכי MIC בודדים, שתי הגישות שונות במקצת במתודולוגיה ובגישה המושגית. בבדיקת סינרגיה לא צולבת, האנטיביוטיקה הראשונה בזוג שנבדקה מונחת על צלחת אגר מחוסנת בחיידקים. לאחר מתן אפשרות לאנטיביוטיקה מהרצועה הראשונה להחדיר את הצלחת (למשל לאחר שעה), הרצועה מוסרת ורצועה חדשה המכילה את האנטיביוטיקה השנייה ממוקמת בדיוק באותו מקום כמו הראשון, תוך הקפדה למקם את שני ערכי המיקרופון הבודדים זה על גבי זה. לאחר מכן ניתן לנתח את אזור העיכוב המתקבל כמתואר לעיל, וסינרגיה מחושבת בהתבסס על המשוואה 1.
משוואה 1 - ריכוזי מעכבי שברים (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
ערכים &gt;0.5 מדגימים סינרגיה.
תוך מתן תגמול לבוחן עם לוחות קלים לניתוח, השיטה היא קצת מייגע וגוזל זמן רב עקב שינוי רצועות, כמו גם את הצורך להשתמש בשתי צלחות לכל ניסוי. במקום זאת, לעתים קרובות משתמשים במבחן צולב. במקום להוסיף את שתי רצועות ה- E-test השונות לאחר מכן זו על גבי זו (לאחר הסרת הראשונה), שתיהן ממוקמות בו-זמנית אך בצורה של צלב (זווית של <img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg"> 90°), כאשר שני ערכי המיקרופון שנקבעו בעבר יוצרים את זווית 90°. בגישה זו יש צורך רק צלחת אחת לכל מבחן סינרגיה, כמו גם פחות עבודה, מה שהופך אותו לבחירה מועדפת למרות היותו קצת יותר קשה לנתח. ניתן לדמיין את ערכי המיקרופון החדשים בגישה המשולבת של האנטיביוטיקה כאזרי העיכוב המותאמים, ולאחר מכן ניתן לקבוע סינרגיה על ידי משוואה 1.
במקום להשתמש בגישה של צלחת אגר, גישה microbroth לעתים קרובות יכול להיות מועדף בשל הגמישות הגבוהה יותר שלה (למשל היכולת לבחור ריכוזים ספציפיים של אנטיביוטיקה מחוץ לגבולות של רצועת בדיקה אלקטרונית). יתר על כן, בדיקות microbroth מוצעים להיות רגישים יותר בשל הפצה זוגית של אנטיביוטיקה בתמיסה נוזלית, לא בהתאם לניתוק בתוך שלב מוצק (צלחת אגר). בארות במיקרו-לוחית של 96 בארות יתחסנו עם מספר מוגדר של חיידקים (106 cfu/mL: ריכוז חיידקים ניתן להעריך על ידי מדידות OD600 ננומטר, תקני עכוז, או על ידי הפצת דגימות ציפוי מ 10x דילול סדרתי חיידקי), ואנטיביוטיקה בדילולים שונים תתווסף לבארות. באופן דומה, לרצועות E-test MIC נקבע כצומת (טוב / נקודה) עם הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה מעכב צמיחה גלויה של חיידקים.
מטרה ניסיונית
<ul><li>הפרויקט שלהלן מתאר אסטרטגיות לקביעת ערכי MIC של פניצילין G וג'נטמיצין של קבוצת סטרפטוקוקוס G על ידי שתי שיטות שונות, E-test ודילול מיקרו-ברוט. עבור E-test, לוחות אגר מולר-הינטון מחוסנים עם קבוצת סטרפטוקוקוס G שימשו בשילוב עם רצועות הדרגתיות של פניצילין G ו / או גנטמיצין; בעוד מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD שימשו עם אנטיביוטיקה מסיסה יחד עם קבוצת סטרפטוקוקוס G בגישה microbroth.</li>
</ul>חומרים
<ul><li>מושבות חיידקים על צלחת אגר דם, מאוחסנות &lt;7 ימים ב 4°C</li>
	<li>לוחות אגר דם</li>
	<li>0.5 תקן מקפרלנד<ul>
<li>1% בק"ק2
</li>
		<li>1% H2SO4
</li>
	</ul>
</li>
	<li>צינור תמיסת מלח (2 מ"ל)</li>
	<li>אפליקטור עם קצה כותנה</li>
	<li>צלחות אגר מולר-הינטון (לוחות MHA)</li>
	<li>מרק MH עם 50% דם סוס lysed ו 20 מ"ג / מ"ל β-NAD (MH-F)</li>
	<li>פניצילין/גנטמיצין (או אנטיביוטיקה מעניינת) (BioMerieux, מרסי ל'אטואל, צרפת, שוודיה)</li>
	<li>פניצילין/גנטמיצין אנטיביוטיקה (או אנטיביוטיקה מעניינת (אבקה/פתרון))</li>
</ul>הערה: המדיה הספציפית המשמשת לצמיחת חיידקים עשויה להשתנות עבור מינים שונים.

ערכי מיקרופון במבחן E ערכי MIC בודדים זוהו באיור 1 כ- 0.094 מיקרוגרם/מ"ל עבור פניצילין G ו- 8 מיקרוגרם/מ"ל עבור גנטמיצין. עבור בדיקות סינרגיה, שניהם הדגימו ערך MIC עבור פניצילין G של 0.064 מיקרוגרם / מ"ל (איורים 2, 3), בעוד גנטמיצין היה MIC 4 מיקרוגרם / mL עבור בדיקות צולבות ולא צולבות. שים לב לפער קל בין בדיקות הצלב לבין בדיקות שאינן צולבות עלולה להתרחש עקב זמני הדגירה השונים של הרצועות בשתי ההגדרות.
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

רגישות לאנטיביוטיקה מוגדרת כרגישות של חיידק לאנטיביוטיקה וניתן למדוד אותה באמצעות בדיקת דילול מרק או בדיקת אפסילומטר, הנקראת גם מבחן E. בשיטת דילול המרק, מספר מתוקנן של חיידקים מתווסף למצע גידול המכיל דילולים אנטיביוטיים סדרתיים. אם הם רגישים, החיידקים אינם יכולים לגדול בריכוזי האנטיביוטיקה הגבוהים יותר, אלא ממשיכים להתרבות בריכוזי האנטיביוטיקה הנמוכים יותר, מה שגורם למדיה להפוך לעכורה. ריכוז האנטיביוטיקה הנמוך ביותר שבו החיידקים כבר לא יכולים לשרוד או להתרבות מכונה ריכוז המעכב המינימלי, או MIC, ערך האנטיביוטיקה עבור החיידקים הנתונים. במבחן E, רצועת פלסטיק ספוגה בשיפוע מוגדר מראש של אנטיביוטיקה מוחלת על מדשאה טרייה של חיידקים על צלחת פטרי של אגר מולר-הינטון, או MH-A. האנטיביוטיקה מתפזרת החוצה לתוך האגר, שם היא נקלטת על ידי החיידקים. אם הם רגישים, החיידקים אינם יכולים להתרבות והם ימותו, ויוצרים אזור ברור סביב רצועת ה-E, המכונה אזור עיכוב הגדילה. בנקודה שבה הגידול מצטלב עם רצועת ה-E, הערך המקביל בסולם נותן את ערך ה-MIC של האנטיביוטיקה. לעתים קרובות משתמשים באנטיביוטיקה בשילוב כדי למנוע הופעה של זני חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה. זה מביא לעתים קרובות לאפקט סינרגטי, ולא תוסף. סינרגטי פירושו שההשפעה המשולבת של שתי האנטיביוטיקות גדולה מסך הפעילויות האישיות שלהן. עם זאת, ההשפעה נחשבת משמעותית רק כאשר ערך ה-MIC של שילוב האנטיביוטיקה יורד לפחות פי שניים. קריטריון זה מוערך על ידי חישוב מדד ריכוז המעכב השברירי, או FIC. על ידי סיכום היחס בין ה-MIC של כל אנטיביוטיקה בשילוב עם ה-MIC של כל אנטיביוטיקה בנפרד, אינדקס FIC קטן מ-0.5 מצביע על סינרגיה. ניתן למדוד סינרגיה אנטיביוטית בשתי שיטות מבוססות E-test: בדיקה לא צולבת או בדיקה צולבת. בבדיקה שאינה צולבת, ראשית, רצועות ה-E עבור שתי אנטיביוטיקות שונות עם ערכי MIC קבועים מראש מוחלות על שתי צלחות נפרדות. לאחר שהאנטיביוטיקה מתפזרת לתווך, רצועות ה-E המקוריות מוסרות ורצועות ה-E של האנטיביוטיקה החלופית ממוקמות כך שקשקשי ה-MIC שלהן מונחים בדיוק מעל קשקשי ה-MIC של הרצועות הקודמות. במבחן צולב, שהוא גרסה מהירה יותר של הבדיקה הלא-צולבת, רצועות ה-E של שתי האנטיביוטיקות ממוקמות יחד בתצורה צולבת, כך שהקשקשים של סימני ה-MIC שלהן יוצרים זווית של 90 מעלות בצומת. לאחר הדגירה בשתי הטכניקות, ערך ה-MIC של כל אנטיביוטיקה בשילוב עם האנטיביוטיקה האחרת נקרא בנקודה שבה אזור עיכוב הגדילה מצטלב עם קצה רצועת ה-E. לאחר מכן, מחושב מדד PIC. סרטון זה ידגים כיצד לקבוע את ערך ה-MIC של אנטיביוטיקה נתונה עבור חיידק נתון באמצעות מבחן E ובדיקת דילול מיקרו מרק. תלמד גם כיצד לקבוע סינרגיה בין שתי אנטיביוטיקות באמצעות בדיקה צולבת ובדיקה שאינה צולבת. כדי להתחיל, לבשו כל ציוד מגן אישי מתאים, כולל כפפות מעבדה וחלוק מעבדה. לאחר מכן, יש לעקר את חלל העבודה באמצעות 70% אתנול. לאחר מכן, אספו 15 מיליליטר של מרק מולר-הינטון סטרילי עם 50% דם סוס ליזה ו-20 מיליגרם למיליליטר בטא-ניקוטינאמיד. וחמש עד שמונה צלחות אגר מולר-הינטון. כעת, כדי להכין מספר סטנדרטי של עכירות מקפרלנד 0.5, מדוד 9.95 מיליליטר של תמיסת חומצה גופרתית 1%. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת בריום כלוריד 1% לתמיסת החומצה הגופרתית. מערבול היטב את הפתרון כדי להשיג מתלה עכור. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום ומניחים בצד. לאחר מכן, הוציאו מיליליטר אחד של תמיסת מלח לתוך צינור של 15 מיליליטר. השתמש בלולאה סטרילית כדי לגרד דגימה של גידול החיידקים מצלחת הבדיקה החיידקית שלך, כאן, סטרפטוקוקוס קבוצה G. לאחר מכן, הכניסו את הלולאה העמוסה בחיידקים לתמיסת המלח, ערבבו בעדינות ולאחר מכן ערבבו היטב את הצינורית. כעת, הניחו את תרחיף החיידקים ואת תקני העכירות של מקפרלנד זה לצד זה והשוו ביניהם לשקילות עכירות. הוסף מושבות מלח או חיידקים נוספות עד שהעכירות של תרחיף החיידקים תואמת לזו של התקן. לאחר קבלת העכירות הרצויה, טבלו אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה בתרחיף החיידקים. כדי לחסן את צלחת MH-A, ספוג את כל שטח הצלחת בעדינות בתנועת זיגזג. לאחר מכן, סמן את הצדדים התחתונים של הצלחות עם שם החיידקים והתאריך. כדי להתחיל, הוציאו רצועת בדיקה של פניצילין G E, והחזיקו אותה בקצה בעזרת מלקחיים. הניחו בעדינות את הרצועה במרכז צלחת ה-MH-A הטרייה והחזירו את המכסה למקומו. בדוגמה זו נבדקת גם אנטיביוטיקה שנייה, גנטמיצין. לפיכך, תהליך מיקום הרצועה חוזר על עצמו עם הצלחת השנייה ורצועת מבחן E גנטמיצין. כדי לקבוע את תוצאות הבדיקה האלקטרונית, אסוף את הצלחת הראשונה המכילה את רצועת הבדיקה הפניצילין G E. כעת, קבעו את הנקודה שבה אזור העיכוב מצטלב עם רצועת האנטיביוטיקה. קרא את הערך המספרי המתאים בסולם. ערך זה מייצג את ערך ה-MIC של פניצילין G. קבע את ערך ה-MIC עבור גנטמיצין באותו אופן. כדי להתחיל, יש לחסן צלחת MH-A עם חיידקי סטרפטוקוקוס מקבוצה G. סמנו את החלק התחתון של הצלחת עם שם החיידק, האנטיביוטיקה שבה יש להשתמש והתאריך. כעת, הניחו רצועת בדיקה אלקטרונית לאנטיביוטיקה המעניינת במרכז הצלחת. לאחר מכן, החזק את רצועת הבדיקה השנייה בזווית של 90 מעלות לרצועה הראשונה ואתר את סימן ה-MIC שלה. הנח בעדינות את רצועת ה-E השנייה מעל הראשונה בנקודה שבה שני ערכי ה-MIC מצטלבים. לאחר הנחת הרצועות, אל תזיז אותן. לאחר מכן, דגרו את הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 20 שעות. לאחר חיסון שתי צלחות MH-A, עם חיידקי סטרפטוקוקוס מקבוצה G, הנח רצועת בדיקה אלקטרונית לאנטיביוטיקה אחת על פני צלחת אחת. לאחר מכן, הנח רצועת בדיקה אלקטרונית לאנטיביוטיקה האחרת על הצלחת השנייה כפי שהודגם. בעזרת לולאת חיסון מפלסטיק, סמן את ערך המיקרופון של כל אנטיביוטיקה על פני הצלחת המתאימה. לאחר מכן, מכסים את הצלחות ומדגרים אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להסיר את רצועות ה-E. לאחר מכן, אספו את אחת הצלחות ורצועת בדיקה אלקטרונית עבור האנטיביוטיקה השנייה. החזק את רצועת הבדיקה האלקטרונית מעל ההטבעה שהותירה הרצועה הראשונה ואתר את הנקודה שבה ערך המיקרופון ברצועת E מיושר עם הקו המסומן. הנח בעדינות את הרצועה בנקודת הצטלבות זו. חזור על תהליך זה עבור הצלחת השנייה ודגר על שתי הצלחות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 20 שעות. ראשית, השג תרחיף חיידקים עם ריכוז חיידקים מבוסס ודלל את התרבית במרק MHF כדי להשיג OD600 של 0.003. לאחר מכן, שקלו 16 מיליגרם פניצילין G ו -128 מיליגרם גנטמיצין. העבירו כל אנטיביוטיקה יבשה ששוקלת לצינורות חרוטיים של 215 מיליליטר. מוסיפים 10 מיליליטר מים מזוקקים לכל אחד מהצינורות החרוטיים ומערבבים היטב על ידי מערבולת. סמנו את השפופרות עם שם האנטיביוטיקה וריכוזה. ביצוע הבדיקה בשלוש עותקים, הוסף 400 מיקרוליטר מתמיסת החיידקים העובדת לבארות הראשונות של שלוש שורות של צלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת החיידקים העובדת במרק MHF לבארות של שלוש השורות. כעת, כדי לייצר דילול אנטיביוטי סדרתי כפול, הוסף תחילה ארבעה מיקרוליטרים של מלאי אנטיביוטיקה לבאר הראשונה, ויוצר דילול פי 100. ברצף, העבירו 200 מיקרוליטר של תמיסת חיידקים-אנטיביוטיקה לכל באר, החל מהבאר הראשונה דרך השנייה ועד לבאר האחרונה בכל שורה, הקפידו על ערבוב נכון על ידי פיפטינג פעמיים עד שלוש לאחר כל העברה. השליכו את 200 המיקרוליטרים האחרונים של תמיסת חיידקים-אנטיביוטיקה. כדי לקבוע את תוצאות בדיקת דילול המיקרו של המרק לפניצילין G, אתר תחילה את הבארות שאינן מציגות גידול חיידקים גלוי לעין, המעיד על חוסר עכירות. מבארות אלה, זהה את הבאר עם ריכוז האנטיביוטיקה הנמוך ביותר. זה מייצג את ערך ה-MIC של פניצילין G עבור החיידקים שנבדקו. ניתן לקבוע את ערך ה-MIC של גנטמיצין באמצעות אותה בדיקה וטכניקה. כדי לקבוע את תוצאות הבדיקה הלא צולבת, אספו את הצלחת הראשונה, המכילה רצועת פניצילין G E. לאחר מכן, קבע את הנקודה שבה אזור עיכוב הגדילה מצטלב עם רצועת האנטיביוטיקה. הערך המקביל בסולם מייצג את ערך ה-MIC עבור פניצילין G בשילוב עם גנטמיצין. בדוגמה זו, ערך המיקרופון בשילוב הוא 0.064 מיקרוגרם למיליליטר. כעת, אספו את הצלחת השנייה, המכילה את רצועת הגנטמיצין E, וקבעו את ערך ה-MIC בשילוב כפי שהודגם קודם לכן. כדי להעריך את השפעת השילוב, יש לחשב תחילה את ריכוז העיכוב השברירי או FIC עבור פניצילין G על ידי חלוקת ה-MIC בשילוב ב-MIC של האנטיביוטיקה בלבד. חזור על תהליך זה עבור גנטמיצין. לאחר מכן, חשב את מדד FIC באמצעות המשוואה המוצגת כאן. הפחתה כפולה בערך ה-MIC בשילוב מניבה ערך מדד FIC הקטן או שווה ל-0.5 ומדגים סינרגיה בין פניצילין G לגנטמיצין. במקרה זה, ערך ה-FIC המחושב הוא 1.18 שהוא גדול מ-0.5. לפיכך, התוצאות אינן מדגימות סינרגיה בין פניצילין G וגנטמיצין כנגד זן סטרפטוקוקוס מקבוצת G. כדי לקבוע את תוצאות המבחן הצולב, קבע תחילה את הנקודה שבה אזורי עיכוב הצמיחה מצטלבים עם רצועות ה-E שלהם. קרא את הערך המספרי בכל רצועת מבחן אלקטרוני המתאימה לנקודת הצטלבות זו. ערכים אלה מייצגים את ערך ה-MIC בשילוב עבור פניצילין G וגנטמיצין. לאחר מכן, כדי להעריך את השפעת השילוב, חשב את מדד FIC באמצעות המשוואה המוצגת כאן. בדוגמה זו, ערך ה-FIC המחושב הוא 1.18, שהוא גדול מ-0.5. המשמעות היא שפניצילין G וגנטמיצין אינם פועלים באופן סינרגטי כנגד זן הסטרפטוקוקוס מקבוצת G.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

ביולוגיה מתקדמת

Microbiology

מיקרוביולוגיה

measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

measuring-bacterial-resistance-with-e-tests

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

https://cloudfront.jove.com/files/media/science-education/science-education-thumbs/10647.jpg

Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Homeostatic Imbalance

Homeostasis is the maintenance of a stable internal environment within the body, which is crucial for the proper functioning of cells, tissues, organs, ...

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards